干旱对不同水稻萌发种子中逆境生理及相应基因表达的影响

摆小蓉,闵炜芳,石亚飞,舍杨梦斐,田浩天,罗成科

(宁夏大学 农学院,宁夏 银川 750021)

我国干旱和半干旱区约占国土总面积的1/2以上,据估计干旱造成的危害接近于其他多种自然灾害影响的总和[1]。在非生物胁迫中,干旱是影响植物生长发育的主要胁迫因子之一,破坏了植物体内的水分平衡,紊乱了植物细胞中的新陈代谢,引起植物一系列表型、生理生化和分子水平的变化,阻碍植物正常生长[2]。水稻(OryzasativaL.)是重要的粮食作物,全世界约115个国家生产水稻,超过半数以上的人口以稻米为主食。但由于干旱的频繁发生,抗旱性差的水稻品种受其影响严重减产[3]。种子萌发是植物体整个生长发育过程的起始阶段,同时也是种子对外界环境干扰响应最敏感的时期[4]。种子萌发是指种子从吸胀作用开始的一系列有序的生理过程和形态发生过程,在萌发的过程中除了形态特征变化,还伴随着相关酶的变化[2]。水分是种子萌发期必备的条件,参与种子萌发的多个生理生化过程。植物通过足够的水分活化相关酶,分解种子内贮藏的有机物质,加快新陈代谢,促进种子萌发[5]。然而,干旱胁迫会延长种子萌发时间,减缓发芽速度,降低发芽率,影响作物萌发期进程[6]。因此,萌发种子的抗旱强弱性可从一定程度上反映作物的抗旱性[7]。

逆境胁迫导致植物体内活性氧(ROS)大量积累,进而对胞内关键酶、蛋白质和核酸造成氧化损伤[8-9]。因而,植物需要通过积累渗透调节物质、激活抗氧化系统来清除大量积累的ROS,维持ROS产生和清除之间的平衡,以此来提高植物的抗逆性。许健等[10]研究发现,干旱胁迫降低了萌发期玉米种子的发芽率、发芽势,抑制了胚根和胚芽的生长。裴帅帅等[11]研究表明,干旱胁迫下,萌发期不同谷子品种的相对发芽势、相对发芽率、发芽指数和抗旱指数都呈下降趋势;SP、MDA、Pro含量,SOD和POD活性都有所升高,各材料间差异较显著。其中,晋谷45的Pro、SP含量、SOD和POD活性比对照分别提高462.34%,34.17%,113.84%,61.22%。鞠乐等[12]研究发现,随着干旱胁迫程度的增加,萌发期大麦种子的SOD活性、MDA、Pro、SS、SP含量变化均呈显著的上升趋势,CAT和POD活性的变化基本呈先上升后下降的趋势。其中,强抗旱性材料Z037P017Q-1的SOD、POD、CAT活性和SS含量显著高于其余材料。田又升等[13]研究发现,干旱胁迫下,相较于干旱敏感型品种新陆早27号,抗旱型品种新陆早50号的脯氨酸合成基因GhP5CS、过氧化物酶基因GhPOD、过氧化氢酶基因GhCAT的表达水平均明显增加,但超氧化物歧化酶基因GhSOD表达水平无明显差异。

前人对萌发期不同作物抗逆(抗旱、耐盐、耐冷等)种质资源筛选评价进行了大量的研究,而对逆境胁迫下萌发种子内部生理特性的变化研究较少,尤其对干旱胁迫下萌发的水稻种子内部生理特性及其相应基因表达水平的变化更是鲜有报道。本研究在前期“种子萌发期粳稻种质资源耐旱性综合评价”[14]研究基础上,挑选了3个抗旱性材料(Farry、松粳3号、宁粳36)和3个旱敏感材料(Calrose、京宁10号、山形86),在种子萌发期进行模拟干旱胁迫(15% PEG-6000)处理,通过比较分析不同萌发种子生长指标、生理及相应基因表达水平的变化,为揭示萌发期水稻抗旱性机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为3个旱敏感材料(Calrose、京宁10号、山形86)和3个抗旱性材料(Farry、松粳3号、宁粳36)。

1.2 试验设计

针对不同水稻材料,分别选取籽粒饱满、大小一致的种子,经15%次氯酸钠溶液消毒30 min,蒸馏水冲洗数次后,均匀地置于底部铺有2层无菌滤纸的培养皿中,置于人工气候箱中萌发,培养条件为12 h/12 h(光照/黑暗),温度28 ℃/26 ℃(白天/夜间)。设置处理如下:蒸馏水做对照(CK),15% PEG-6000模拟干旱胁迫处理,试验过程中及时补充蒸馏水或PEG-6000 溶液,连续处理7 d(DS)。在种子萌发期第1,3,5,7天取样,萌发指标测定样品为萌发种子,生理指标和基因表达量测定样品为去除胚根与胚芽的种子。每个处理3个重复,每个重复50粒。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 萌发指标的测定 发芽标准为胚根突破种皮1 mm、胚芽为种子长度1/2[15]。每日定时测定发芽种子数,计算相对发芽势、相对芽长、萌发抗旱指数和活力指数,具体公式详见参考文献[14]。

1.3.3 总RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR分析 使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa) 对2种处理(CK、DS)下的不同抗旱性水稻种子进行 RNA 提取。RNA提取液使用NanoDrop 2000/2000c(Gene Company Limited)分光光度计检测纯度和浓度。选取A260/280比值为1.8～2.2且A260/230比值约为2.0的样品进行后续分析。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)去除基因组DNA污染并反转录获得cDNA。根据Rice Genome Annotation Project(http://rice.uga.edu/)中的序列,采用Primer Premier 5进行 RT-qPCR 引物设计,引物信息参见表1。根据 TaKaRa 公司的 TB Green®PremixExTaqTMⅡ试剂使用说明书,用qTOWER3G(Analytikjena,Germany)进行 RT-qPCR 试验。每个样品进行3次重复。RT-qPCR 结果采用 2-ΔΔCt方法计算各基因的相对表达量[17]。

表1 检测的基因和RT-qPCR引物序列

1.4 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016软件整理数据,SPSS 21.0软件进行统计分析,差异显著性定义为P<0.05,用平均值±标准误表示3次重复测定结果,采用Origin 2021 b与GraphPad Prism 8作图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下萌发期不同水稻生长指标的影响

由表2可知,正常条件下,3种抗旱性材料之间,发芽势、芽长、活力指数和萌发指数均无显著差异;而旱敏感材料之间则表现为,除芽长外,3种旱敏感材料的发芽势、活力指数和萌发指数均无显著差异。在不同类型材料之间相比,除活力指数外,抗旱性材料Farry、松粳3号和宁粳36的发芽势、芽长和萌发指数显著高于旱敏感材料Calrose、京宁10号和山形86。

表2 正常条件下萌发期水稻的生长指标

进一步利用相对发芽势、相对芽长、萌发抗旱指数和活力指数分析干旱胁迫对水稻种子萌发的影响,结果表明,对抗旱性材料而言,除萌发抗旱指数表现出宁粳36显著高于其他2个抗旱性材料外,其余指标在3个材料间无显著差异;对于旱敏感材料,相对芽长和萌发抗旱指数在3个旱敏感材料间无显著差异,但活力指数表现出Calrose和京宁10号显著高于山形86。不同基因型水稻间相比,抗旱性材料宁粳36的相对发芽势显著高于旱敏感材料(Calrose、京宁10号和山形86),抗旱性材料(Farry、松粳3号)的相对发芽势显著高于旱敏感材料山形86;其余3个指标(相对芽长、萌发抗旱指数、活力指数)的变化趋势与相对发芽势的变化趋势基本一致(图1)。其中,相比于旱敏感性材料,抗旱性材料萌发种子的相对发芽势(RGP)、相对芽长(RSL)、萌发期抗旱指数(GDRI)和活力指数(VI)分别增加了0.03～0.07百分点,0.32～0.39百分点,0.12～0.18百分点和92.41%～108.39%。表明相对于旱敏感材料,抗旱性材料的种子发芽速率更快,种子活力更高,抗旱性更强。

不同小写字母表示不同材料间0.05水平差异显著(P<0.05)。

2.2 干旱胁迫对萌发期不同水稻丙二醛和活性氧含量的影响

不同小写字母表示各处理下不同品种间0.05水平差异显著。图3—4同。

2.3 干旱胁迫对萌发期不同水稻抗氧化酶活性及渗透调节物质含量的影响

由图3-A—C可知,正常条件下在各萌发时间点,除萌发7 d种子中的POD活性外,萌发种子中的SOD、POD活性(以鲜质量计)在不同抗旱性材料之间无显著差异。相较于正常条件,干旱胁迫下各萌发时间点不同抗旱性水稻萌发种子中的SOD和POD活性均明显增加。其中,抗旱性材料宁粳36的SOD活性显著高于旱敏感材料(Calrose、京宁10号)。由图3-C可知,对CAT活性(以鲜质量计)来说,无论正常条件还是干旱胁迫,不同抗旱性水稻萌发种子中其活性随着萌发时间的延长逐渐增强。相较于正常条件,干旱胁迫下不同抗旱性水稻萌发种子中的CAT活性均有增加,其中,抗旱性材料Farry、松粳3号和宁粳36中的CAT活性明显高于旱敏感材料Calrose和京宁10号。其中,相比于旱敏感性材料,抗旱性材料的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性分别提高17.29%～33.12%,15.24%～76.06%和14.68%～18.61%。

图3 干旱胁迫对萌发期不同水稻抗氧化酶活性及渗透调节物质含量的影响

由图3-D—F可知,正常条件下萌发1～3 d内,抗旱性材料Farry、松粳3号和宁粳36萌发种子中的Pro、SP含量(以鲜质量计)明显高于旱敏感材料Calrose、京宁10号和山形86。萌发5～7 d内,抗旱性材料宁粳36萌发种子中的这2种渗透调节物质含量明显高于其他3种材料。除萌发3 d,旱敏感性材料山形86的SS含量显著低于抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)外,其余时期SS含量在不同抗旱性材料之间均没有显著差异。相比于正常条件,在整个萌发期内,干旱胁迫明显增加了不同抗旱性材料萌发种子中的Pro含量,但并没有明显增加SP和SS含量。相比于旱敏感材料Calrose、京宁10号和山形86,萌发第1～3天内抗旱性材料Farry、松粳3号和宁粳36萌发种子中的Pro含量显著增加,萌发第5天只有宁粳36的Pro含量显著增加。SP含量明显增加则表现在萌发第3,7天的宁粳36种子中。对于SS含量来说,萌发第3天的Farry和松粳3号种子显著高于旱敏感材料山形86,萌发第5～7天3种抗旱性材料均显著高于旱敏感材料。其中,相比于旱敏感性材料,抗旱性材料的渗透调节物质(Pro、SS、SP)含量分别增加了5.93%～18.29%,1.08%～7.97%和3.47%～6.03%。

2.4 干旱胁迫对萌发期不同水稻抗氧化物酶合成基因及脯氨酸合成基因相对表达量的影响

OsALM1、OsPOX1、OsCATC和OsP5CS是编码抗氧化酶SOD、POD、CAT和脯氨酸Pro合成基因。如图4所示,正常条件下,水稻萌发种子中的OsALM1、OsCATC、OsPOX1和OsP5CS基因表达量在不同抗旱性材料之间无显著差异。相较于正常条件,干旱胁迫不同程度地诱导了不同抗旱性水稻萌发种子中这4个基因的相对表达水平。其中,抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)萌发种子中ALM1和CATC基因相对表达量明显高于旱敏感材料(Calrose、京宁10号和山形86),基因表达量分别增加了2.81,2.90,2.08倍。对于OsPOX1和OsP5CS基因相对表达量变化来说,它们仅在宁粳36的表现显著高于旱敏感材料Calrose、京宁10号和山形86,基因表达量分别增加了1.97,1.96,2.03倍。其中,相比于旱敏感性材料,抗旱性材料的脯氨酸合成关键基因OsP5CS、抗氧化酶合成基因(OsALM1、OsPOX1、OsCATC)的相对表达量分别上调了2.66%～182.31%,57.14%～513.27%,0.38%～109.06%和63.39%～184.25%。

图4 干旱胁迫对萌发期不同水稻抗氧化物酶合成基因及脯氨酸合成基因相对表达量的影响

2.5 干旱胁迫下萌发期不同水稻中各指标间的相关性分析

CAT.过氧化氢酶;SOD.超氧化物歧化酶;POD.过氧化物酶;SS.可溶性糖;MDA.丙二醛;SP.可溶性蛋白;Pro.脯氨酸;H2O2.过氧化氢;超氧阴离子;RGP.相对发芽势;RSL.相对芽长;GDRI.萌发抗旱指数;VI.活力指数;OsP5CS.脯氨酸合成基因;OsPOX1.过氧化物酶基因;OsCATC.过氧化氢酶基因;OsALM1.超氧化物歧化酶基因。*.在P<0.05水平差异显著,图6同。

2.6 干旱胁迫下萌发期不同水稻中各指标间主成分分析及各指标参数的选择

在相关性分析的基础上,进一步对干旱胁迫下萌发期不同水稻中的以上17个指标进行了主成分分析,根据指标选择的原则,提取3个主成分进行分析。对抗旱性材料(Farry、松粳3号、宁粳36)来说,第1主成分包括OsPOX1、OsP5CS、OsCATC,第2主成分包括VI、POD,第3主成分为SP(图6-A—C),本研究认为OsPOX1、OsP5CS、OsCATC、VI、POD、SP是影响抗旱性材料的关键指标;对旱敏感材料(Calrose、京宁10号、山形86)而言,第1主成分包括VI、RSL、OsPOX1,第2主成分包括OsALM1、POD,第3主成分为H2O2(图6-D—F),本研究认为VI、RSL、OsPOX1、OsALM1、POD、H2O2是影响旱敏感材料的关键指标。

图6 干旱胁迫下萌发期不同水稻中各指标间的主成分分析

3 结论与讨论

3.1 干旱胁迫对不同水稻种子萌发的影响

水分是限制种子萌发的主要环境因子。种子萌发期极易受水分的影响,一旦水分短缺,将会导致种子萌发困难,发芽率下降。在进行作物种子萌发期抗旱性鉴定时,常采用相对发芽势、相对芽长、活力指数和萌发抗旱指数等指标来评价作物不同种质资源的抗旱性强弱[18]。例如,在评价萌发期不同黑小麦[19]、不同燕麦[20]抗旱性时,这些作物的抗旱性材料通常长势较好,生长指标受胁迫抑制小,而旱敏感性材料长势较差,生长指标受胁迫抑制大。本研究结果也表明,干旱胁迫抑制了2种基因型水稻种子发芽势、芽长和种子活力。相较于旱敏感性材料(Calrose、京宁10号和山形86),抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)的相对发芽势、相对芽长、活力指数以及萌发抗旱指数均明显增加,说明抗旱性材料的生长指标受干旱胁迫影响较小,其对干旱胁迫的适应性更强。

3.2 干旱胁迫对不同水稻萌发种子内生理特性的影响

逆境胁迫下,植物能够启动抗氧化防御系统(抗氧化酶、非酶类抗氧化剂)来清除体内过多的ROS,其中抗氧化酶被认为是清除ROS最直接、最有效的途径[27]。段骅等[28]研究发现,相较于正常条件,干旱胁迫下,萌发期不同抗旱性水稻的SOD、POD、CAT活性均明显增加。其中,抗旱性品种黄华占的抗氧化酶活性显著高于旱敏感性品种双桂1号。另外,萌发期不同水稻抗旱性的其他研究报道也证明了抗旱性材料中的各种抗氧化酶活性明显高于旱敏感性材料[29]。本研究结果表明,干旱胁迫均明显增加了各萌发时间点不同水稻萌发种子中的SOD、POD、CAT活性。其中,3个抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)中SOD和POD活性均显著高于3个旱敏感材料(Calrose、京宁10号和山形86),3个抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)中CAT活性明显高于2个旱敏感性材料(Calrose和京宁10号),说明萌发期抗旱性强的水稻材料可以通过合成更多的抗氧化酶来清除过量的ROS,进而增强其抗旱性。

植物还可以通过积累渗透调节物质(Pro、SP、SS)来保护自身免受非生物胁迫损伤[16]。在干旱胁迫下,渗透调节物质含量的增加有利于维持胞质膨压,其中,脯氨酸还对ROS有直接的清除作用[30]。赵振宁等[31]研究发现,干旱胁迫下不同大豆萌发种子胚根中渗透调节物质含量相比正常条件均有增加,其中,抗旱性材料中Pro、SS、SP含量显著高于旱敏感性材料。本研究结果也表明,相比于正常条件,干旱胁迫明显增加了不同水稻萌发种子中3种渗透调节物质的含量。其中,萌发期抗旱性材料宁粳36中SP含量明显高于3个旱敏感材料(Calrose、京宁10号和山形86),萌发前期1～3 d抗旱性材料Farry和松粳3号中Pro和SS含量、宁粳36中Pro含量均明显高于3个旱敏感材料,而萌发后期5～7 d抗旱性材料宁粳36中Pro和SS含量、Farry和松粳3号中SS含量明显高于3个旱敏感材料,说明抗旱性材料通过积累更多的渗透调节物质来提高自身抗旱性。

3.3 干旱胁迫对不同水稻萌发种子内抗氧化酶与脯氨酸合成基因表达量的影响

植物抗旱机制十分复杂,受到各种生理生化过程和基因表达水平的综合调控。其中,抗氧化酶活性和渗透调节物质积累受相应基因的表达控制,如OsALM1、OsPOX1、OsCATC分别是SOD、POD、CAT抗氧化酶合成基因,OsP5CS是渗透调节物质脯氨酸合成基因。Luo等[16]研究表明,相较于正常条件,干旱胁迫显著上调了抗氧化酶基因OsALM1、OsPOX1、OsCATC和脯氨酸合成基因OsP5CS的表达水平。与单独干旱胁迫相比,褪黑素预处理更加明显地促进了干旱胁迫水稻中这些基因的表达水平。Challabathula等[32]研究发现,在干旱胁迫条件下,抗旱品种Vaisakh中编码Cu/Zn SOD、CAT和APX酶基因的表达量明显高于旱敏感品种Aiswarya,说明这些抗氧化酶为抗旱品种抵御ROS毒害提供了先天保护。本研究表明,干旱胁迫明显诱导了萌发期不同水稻中抗氧化酶基因(OsALM1、OsPOX1、OsCATC)和脯氨酸合成基因OsP5CS的表达水平。其中,抗旱性材料(Farry、松粳3号和宁粳36)中OsALM1和OsCATC基因表达量的上调程度均明显大于旱敏感材料(Calrose、京宁10号和山形86),而对于OsPOX1和OsP5CS基因表达量的上调程度而言,抗旱性材料宁粳36明显高于3个旱敏感材料。说明抗旱性材料通过上调抗氧化酶合成基因和脯氨酸合成基因的表达水平,激活植物抗氧化防御系统和增强渗透调节能力,从而增强萌发期水稻的抗旱性。

3.4 萌发期不同水稻抗旱性关键指标选择

萌发期作物抗旱性是一个复杂的数量遗传性状。萌发期作物在干旱胁迫下会调节体内生理生化反应,并能激活抗旱相关基因表达,从而做出对干旱胁迫的响应和适应。在评价萌发期作物抗旱性的过程中,选择单一或少数几个指标存在一定的片面性,为了做出全面、科学的评价,需要从形态、生理及相应基因表达量等多个层次选择抗旱性相关指标[33]。例如,范蓉[34]在综合分析苗期不同抗旱性棉花材料时,选择5个抗逆生理指标(MDA、Pro含量,SOD、POD活性和电导率)和4个基因表达量(GhHSP70-26、GhHsfA7、GhbZIP15和GhNAC2)共9个指标进行相关性分析,分析结果表明,这些指标与棉花苗期干旱胁迫应答反应密切相关,其中,SOD、POD、Pro、GhHSP70-26、GhHsfA7、GhbZIP15、GhNAC2这7个指标是影响棉花幼苗抗旱性的关键指标。本试验对干旱胁迫下萌发期不同水稻中的生长指标、生理指标及其相应基因表达量共17个指标进行相关性和主成分分析,筛选获得了萌发期抗旱性水稻的关键指标是OsPOX1、OsP5CS、OsCATC、VI、POD、SP,萌发期旱敏感水稻的关键指标是VI、RSL、OsPOX1、OsALM1、POD、H2O2,说明不同基因型水稻在响应干旱胁迫过程中存在一定的生理和分子特性差异。

干旱胁迫抑制了水稻种子的萌发,影响了萌发期种子中的生理特性及其相应基因的表达。干旱胁迫下,无论是抗旱性材料还是旱敏感性材料,VI、POD以及OsPOX1是影响水稻种子萌发的关键指标。除以上指标外,SP、OsP5CS、OsCATC是影响抗旱性材料的其他关键指标,RSL、H2O2、OsALM1是影响旱敏感性材料的其他关键指标。