冠状病毒相关靶点的PET成像研究进展

丁缙，李大鹏，张倩，孟祥溪，刘特立，杨志，朱华

（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所核医学科 国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142）

2019冠状病毒病（COVID-19）自2020年初开始席卷全球，截至2022年6月30日已蔓延至全球超过220个国家和地区，累计造成逾5.4亿万名确诊病例，逾630万名患者死亡[1]。造成这一重大疫情的“元凶”新冠病毒，于2020年2月11日被国际病毒分类委员会正式命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）[2]。SARS-CoV-2是一种凶猛的RNA复合病毒，可导致高度传染性呼吸道疾病，其症状不仅包含各种普遍的呼吸系统疾病，还包括更严重的并发症，如特发性肺纤维化、肺炎、急性呼吸窘迫甚至多器官衰竭和死亡[3]。

病毒通常由2个或3个成分组成：遗传物质（RNA或DNA）、由蛋白质形成的衣壳（包裹和保护其中遗传物质）及环绕在外的脂质包膜（存在于部分病毒中）。其中，表面蛋白决定了病毒的传播能力、传播范围，是抗病毒药物、治疗性抗体开发的重要靶标，在诱导中和抗体和T细胞反应以及免疫保护中起关键作用。内部遗传物质的遗传信息决定病毒的复制方式，从而确定其属种和各项生理机制特征，是研发治疗和抑制患者体内病毒增殖的特效药物的关键指标。对于新型冠状病毒SARSCoV-2来说，纤突蛋白（spike protein，S蛋白）是疫苗设计、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标，而S1蛋白（S蛋白亚基，负责病毒与细胞膜的结合）、受体结合域（receptor binding domine，RBD）、人血管紧张素转化酶2（human angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）等蛋白的特性和应用均是抗病毒药物开发的一个关键。与之相应，RNA的特异性抑制剂是有效控制病毒在体内复制的另外一个关键。

本文针对冠状病毒特异性靶点相关研究和目前已有的SARS-CoV-2特异性药物研发最新进展，通过病毒入侵过程和病毒体内繁殖2个主要方面开展综述，以期能够结合分子影像学研究的相关进展来评价SARSCoV-2特异性药物在人体各个器官的代谢情况，揭示器官中药物代谢过程等系列生物学行为，从影像学角度阐述SARS-CoV-2机制研究和特异性药物研发进展。

1 分子影像技术

现代分子影像技术包括磁共振成像、光学成像、单光子发射计算机断层扫描（single photon emission computed tomography，SPECT）、正电子发射计算机断层扫描（positron emission computed tomography，PET）等，它们均属于非侵入性分子成像技术，但每种技术有各自的优缺点，其中以PET及PET/CT为代表的放射性显像技术因其灵敏度高、信号穿透率强、定量准确等优点脱颖而出，是在目前核医学诊断与治疗中最具优势的一线显像技术[4]。使用核医学影像技术（PET或SPECT）监测SARCoV-2侵入过程关键靶标的靶向标志物，用于在体内无创监控其生物分布、充分了解其生理作用以及促进其在生物医学中的应用，是目前的较佳选择。

2 侵入细胞关键靶点成像

2.1 人血管紧张素转换酶2

血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）是羧肽酶ACE的同源物，羧肽酶生成血管紧张素Ⅱ，这是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的主要活性肽。ACE2与SARS-CoV-2中的S蛋白的结合是目前已报道和确证的病毒进入细胞的通道[5-7]。

ACE2作为SARS-CoV-2侵入细胞的关键位点，引起大量关注，以ACE2为靶点的放射性探针开始出现。2021年2月，美国加州大学旧金山分校的Parker等[8]开展ACE2特异性的环肽药物68Ga-NOTA-PEP4的研究。该研究基于已报道的ACE2特异性结合肽DX600作为修饰前体[9]，体内分布和活体显像结果显示，该示踪剂在心、肝、肺、肠道等易感区域均出现特异性摄取。2021年5月，北京大学肿瘤医院核医学科的Zhu等[10]合成了新型ACE2探针68Ga/64Cu-HZ20，首次在临床试验（共21例健康志愿者，包括一名COVID-19康复患者）中得到ACE2在人体中的全局表达分布的定量结果；同时在康复患者体内的分布情况也可能揭示了ACE2表达水平在感染前后的变化。2021年11月，该课题组的Li等[11]以长半衰期核124I标记病毒突刺蛋白重组得到的RBD，监测该ACE2靶向蛋白的体内分布，并将肺内给药与静脉注射相对比，以期进行初步模拟病毒入侵路径。

2.2 表皮生长因子受体

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因的突变与肺癌相关，其编码的蛋白是一种与表皮生长因子结合的细胞表面跨膜糖蛋白[12]。EGFR是一种多功能信号传感器，参与一系列细胞过程。研究表明，EGFR信号传导介导的对肺损伤的过度活跃反应会引起肺纤维化，而肺纤维化在呼吸道病毒感染特别是SARS-CoV类病毒感染中常见[13-14]。此外，EGFR也与各种病毒活动相关，例如牛痘病毒的传播以及甲型流感病毒、丙型肝炎病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒的侵入等[15-16]。抑制EGFR信号传导可能防止SARS及其他呼吸道病毒感染致肺部纤维化反应[17]。

在包括SARS-CoV-2在内的各相关研究领域中，研究人员对EGFR作用的关注日益增加。2007年，Cai等[18]首次使用64Cu标记的靶向EGFR的西妥昔单抗在EGFR阳性表达的多种动物模型中进行micro-PET显像，并使用阴性模型MDA-MB-435作为对照，结果表明PET定量的示踪剂摄取和通过蛋白质印迹测得的EGFR表达水平之间呈正相关。2011年，Yeh等[19]开发了放射性标记小分子18F-PEG6-IPQA，在不同种突变EGFR表达模型中的PET显像结果表明该放射性探针可用于非小细胞肺癌（NSCLC）个体化治疗中的患者选择。2019年，Xu等[20]合成了靶向EGFR的放射性示踪剂64Cu-NOTA-C225，影像结果表明该探针具备敏感性和特异性地区分不同EGFR表达水平的能力，即对EGFR阳性位点示踪显像的潜力。

2.3 整合素β6

整合素β6（integrin β6，ITGB6）基因是整合素超家族成员，编码整合素β6蛋白。ITGB6是整合蛋白αvβ6的β6亚基，是控制整个异二聚体αvβ6表达的关键性亚单位。在实验模型中观察到，肺纤维化依赖于转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号传导，而整合蛋白αvβ6是肺中的主要TGF-β激活剂[21-23]。ITGB6在肺上皮细胞中的表达可促进肺部发生特发性肺纤维化，所以抑制αvβ6介导的TGF-β激活是治疗肺纤维化的新策略，ITGB6可能成为SARS-CoV-2引发的COVID-19的潜在治疗靶标[24-25]。

整合素αvβ6作为细胞纤维化的潜在生物标志物已成为众多PET显像探针研究领域的热点。2014年、2017年、2020年，国内外各个课题组均发表了以环肽为核心的放射性标记αvβ6靶向探针，并分别对其在以胰腺癌为代表的肿瘤模型中的分布进行了评价，结果表明这些探针具有良好的药代动力学和剂量学特性，有望成为整合素αvβ6的特异性PET放射性示踪剂[26-28]。2013年，Hackel等[29]对2种18F-氟苯甲酸酯标记的αvβ6高亲和的胱氨酸结肽进行了在肿瘤模型中的临床前评估，结果显示放射性探针对胰腺癌和其他癌症中整合素αvβ6过表达部位的分子显像的转化前景。2019年，该课题组对新合成的3种不同放射性核素（64Cu、68Ga、18F）标记的胱氨酸结肽探针做3D结构认证及进一步的临床前实验，并在临床上证明了这几种探针检测患者特发性纤维化肺病的能力[30]。2020年，Maher等[31]在一项Ⅰ期临床试验中对健康志愿者和特发性肺纤维化患者雾化给药新型αvβ6抑制剂GSK3008348，并首次使用放射性标记的αvβ6特异性探针[18F]FBA20FMDV2进行PET显像以评定治疗药物的肺内靶向结合，结果显示，PET显像有助于肺病治疗药开发前期的药理学研究。

2.4 血管内皮生长因子A

血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是由人类VEGFA基因编码的蛋白质。VEGFA属于β-连环蛋白（β-catenin）的标志性靶标分子，而β-catenin参与成肌纤维细胞的活化和肺纤维化的病理过程。动物模型实验与临床试验的结果表明，增加VEGF的递送会加重肺纤维化过程[32-33]。然而SARS-CoV-2引发的COVID-19很明显的一个表型特征是肺部损伤造成呼吸衰竭。

在多种疾病模型中将VEGFA作为靶点进行的研究很多，包括肺癌在内的多种肿瘤模型研究均可能成为SARS-CoV-2病毒研究的实验基础和佐证。2009年，Chen等[34]使用VEGF受体（VEGFR）靶向的放射性PET显像探针64Cu-DOTA-VEGF121对不同大小的人胶质母细胞瘤 U87MG中的VEGFR1和VEGFR2表达进行定量PET显像，并与Western印迹得到的结果进行线性相关比较，阳性的结果表明该探针可能有助于癌症和潜在的其他血管生成相关疾病的治疗和监测。2015年，Zhu等[35]报道了一种新型探针64Cu-DOTA-F56的合成、放射性标记和评价工作，该探针由64Cu标记的修饰肽F56（WHSDMEWWYLLG）构成[35]。对BCG823（VEGFR1阳性）荷瘤小鼠进行的micro-PET显像结果表明，与18F-氟代脱氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）相比，该探针特异性识别该肿瘤的能力更具优势；结合免疫组化结果表明，64Cu-DOTA-F56有可能作为VEGFR1阳性位点的非侵入性显像剂。2016年，Luo等[36]以64Cu标记的人源化雷莫芦单抗（64Cu-NOTA-RamAb）在肺癌动物模型中验证了该探针可作为PET显像剂用于体内VEGFR2表达的可视化，也具备在监测靶向药物治疗中的潜在应用。2020年，Hu等[37]开发了一种新型的VEGFR靶向肽64Cu-VEGF125-136，可在各种小鼠模型中快速显像，注射后1 h内即可达到最高显像质量，在肿瘤血管生成和给药后的即时动态显像方面具有较好的潜力。

3 以病毒为靶标的小分子抑制剂相关分子成像

3.1 remdesivir

2020年1月24日，中国武汉金银潭医院的黄朝林团队在Lancet上在线发表论文，该课题组启动了抗人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）药物洛匹那韦/利托那韦（lopinavir /ritonavir，LPV/r，商品名：克力芝）治疗COVID-19的随机对照试验[38]。这种联合疗法靶向HIV和冠状病毒在复制时用于切割蛋白质的酶（protease）。2020年1月31日NEJM报道显示，美国首例COVID-19患者住院第7天开始使用药物瑞德西韦（remdesivir，RDV，GS-5734），次日退烧，症状减轻[39]。Baric教授团队发表在Nat Commun的研究对“瑞德西韦与蛋白酶抑制剂克力芝（LPV/r）治疗中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）哪一个疗效更好”进行了比较，结果表明预防性和早期使用瑞德西韦能够明显降低SARS-CoV、MERS-CoV感染小鼠的肺组织病毒载量水平，同时改善肺功能、缓解症状；细胞学实验也证明瑞德西韦比克力芝效果更好[40]。2020年10月22日，瑞德西韦成为首个获得FDA紧急使用授权（EUA），用于治疗需住院的COVID-19成人患者及12岁以上儿童患者的抗病毒药物[41-42]。虽然瑞德西韦治疗对部分患者（尤其是肝或肾功能不全的患者）存在副作用，但具有广谱的抗病毒活性[43-44]。2020年11月，江苏省原子医学研究所的Yang等[45]研究团队公开了一项瑞德西韦衍生物的制备技术专利，为合成病毒靶向的放射性探针和放射性治疗药物提供了稳定、可靠的前体。

3.2 中和抗体

相对于完整抗体，纳米抗体具有体积小、高特异性且性质稳定的优点，在生产和临床应用上更具有发展潜力。中和抗体Nb11-59可与SARS-CoV-2中的RBD部位结合，通过占位阻断RBD与人体ACE2的结合过程，起到中和病毒的作用，阻止病毒在生物体内的感染[46]。2022年，Liu等[47]开发和表征了基于中和纳米抗体的新型分子探针68Ga-Nb1159，并在证明其在体外和体内对RBD的中和能力后，通过PET影像证实体内68Ga-Nb1159摄取与RBD残留量呈正相关。这说明基于中和抗体Nb11-59构建的RBD靶向PET探针，可能是实时在体监测病毒感染部位的有效手段之一，并且具备评价其他治疗药物疗效的潜力。

3.3 氟代脱氧山梨醇

由于葡萄糖代谢作为重要的能量供应源在各种增生过程中高度表达，18F-FDG PET/CT常用于肿瘤及其转移灶的检测，也可作为靶向病毒引起的各种炎症及并发症的代谢显像剂。与18F-FDG结构相似的18F-氟代脱氧山梨醇（18F-fluorodeoxysorbitol，18F-FDS）是一种选择性高、灵敏度高的细菌感染显像剂。2014年，美国约翰斯·霍普金斯大学医学院的研究者们发表了18F-FDS在小鼠肌炎模型中对肠杆菌科感染区别于革兰阳性菌和癌细胞的选择性成像研究成果，证明了18F-FDS可能用于肠杆菌科特异性感染的放射性示踪[48]。2015年，Yao等[49]对18F-FDS作为肠杆菌科感染探针的首次临床验证，从获得的健康志愿者的药代动力学和生物分布参数可见，18F-FDS PET显像在活体细菌感染检测中具有良好的应用前景。2020年，美国路易斯维尔大学医学院的Li等[50]发布了18F-FDS与18F-FDG在区分克雷伯菌肺部感染和肺部炎症方面的对比实验结果，实验跟踪数据表明两者均具有检测病变程度的能力，但18F-FDS比18F-FDG在感染与炎症的对比显像中更具特异性。18F-FDS在肺部等病灶感染显像中的应用优势也为其对病毒感染的检测提供了可能。

3.4 氟代胸苷

18F-氟代胸苷（18F-fluorothymidine，18F-FLT）是一种肿瘤特异性PET示踪剂和放射性药物，通过参与DNA合成的主要酶——胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1）的磷酸化作用被捕获于增殖细胞内，从而可作为增殖示踪剂。2012年，Huang等[51]通过对比18F-FLT和5-[123I]碘代阿糖基尿苷（5-[123I]iodo arabinosyl uridine，123I-IaraU）在单纯疱疹病毒1型-胸腺激酶（herpes simplex type 1 virus-thymidine kinase，HSV1-tk）基因转染的鼠纤维肉瘤细胞中的成像结果，表明18F-FLT在HSV1-tk转染的细胞中表现出更优的积累，说明其存在协同的显像效能，而对病毒基因的协同靶向能力使得18F-FLT具有作为核苷类抑制药物类似物研究的潜力。2015年，Wang等[52]针对18F-FDG在肿瘤显像中可能存在的假阳性问题，以18F-FLT进行了对比显像，结果显示对于肺部恶性肿瘤，18F-FLT与18F-FDG相比虽然灵敏度略低，但特异性更高，且对于肺部病变（良性）无论大小均显示出更好的特异性。2021年，Christensen等[53]的临床PET显像研究表明，18F-FLT比18F-FDG更具有对肺癌治疗后复发的诊断价值，且对临床治疗方案的影响更为明显。18F-FLT对于肺部病变的敏感性和特异性也是其成为潜在肺部感染显像剂及治疗药物的重要依据。

4 结语与展望

新型冠状病毒抑制剂的开发旨在切断病毒入侵和阻断病毒繁殖，分别指向2种更具体的关键结构：表面识别蛋白/受体和内部遗传物质。分子探针的指导作用可能成为非侵入治疗病毒感染病灶的新方法。实验室和临床研究表明，EGFR、ITGB6、VEGFA等蛋白受体均通过不同的机制和途径参与和引起肺部的纤维化过程，而这也是COVID-19患者的主要影像学特征。近年来，研究者们发表的靶向上述冠状病毒相关靶点的放射性探针成果证明，分子影像学指导的针对病毒感染症状（如肺纤维化）的诊疗药物设计已经具备理论和现实的基础。

从病毒在细胞内的增殖过程来看，治疗和阻断主要通过2种方式：一是直接靶向遗传物质本身或帮助其增殖的蛋白如RNA复制酶等，抗HIV药物克力芝和新型药物瑞德西韦属于此类；另一种方式是通过特异性靶向被病毒感染的细胞或受体（如ACE2）达到精准诊疗的目的，这也是分子影像学发挥指导意义的主要方式。

靶向ACE2的最新研发药物68Ga-NOTA-PEP4、68Ga/64Cu-HZ20、124I-RBD等诊疗探针，不仅为病毒感染过程的实时监测和病灶发展的预测提供了可能，有助于理解新型病毒感染的临床机制，更为后续的缓释和治疗方案的制定提供方便，且可能通过改变核素种类达到治疗目的。然而对于病毒感染机制的研究目前仍进展缓慢，这一方面是由于临床上难以对确诊患者或康复患者进行大规模采样，以达到与健康志愿者体内数据形成对比得到指导性结论的目的；另一方面，放射性探针PET显像在肿瘤诊疗领域近年来突飞猛进，已经成为一线临床技术，但在病毒学领域仍在起步阶段，各项生化相关数据仍需摸索整合，亟需更为有效、广谱的特异性探针打开领域和视野。

与肿瘤的增生类似，RNA病毒不断复制的过程中一方面需要大量的能量，使得18F-FDG和18F-FDS等代谢探针得以发挥优良的靶向作用；另一方面RNA链和片段的生成需要大量的核苷类化合物作为原料，18F-FLT和18F-FHBG等核苷类分子探针也被研究证明具有特异性的病灶靶向功能。然而，对于病毒RNA靶向的分子探针研究则更为困难，大部分前体依然在临床前评价阶段，而对于在肿瘤和炎症中高特异性的分子更适用于治疗而非预防或诊断。

虽然目前针对病毒的放射性靶向探针研究仍比较初级，但这也为后续的新型探针研发提供了更多可能的方向。从早期检测的角度来看，放射性分子靶向探针无疑具有非侵入性、快捷性和可视化的优势，且目前已有的研究表明新探针的研发具备良好的可行性；从治疗的角度来看，分子探针的实时显像在为治疗药物代谢和疗效等属性作监测和评估的同时，也具有结合靶向治疗达到诊疗一体化的潜力。综上所述，将病毒侵入抑制剂转化为诊断探针，与将病毒繁殖抑制剂转化为治疗探针一样，均具有研究价值和临床需求，而将二者结合的联合显像或联合治疗则具有更广阔的前景。

总之，借助分子影像技术监测体内病毒量的增减趋势，除协助判断抗病毒治疗效果外，还可协助判断对患者的传染能力以及可能的传染媒介，进而指导感染防控的范围、力度和强度以及病毒标本取样的部位与检测的最佳时机。