天门冬总黄酮的提取工艺与抗氧化性研究*

张贵川

（四川卫生康复职业学院，四川自贡 643000）

天门冬（Asparagus cochinchinensis）为百合科天门冬属植物，分布于我国秦岭以南各省份，具有养阴润燥、清肺生津功效，其含有多糖、黄酮和皂苷等多种营养物质，特别是以5,7-二羟基-6,8,4-三甲氧基黄酮为代表的黄酮类化合物是其主要成分之一[1，2]。黄酮类化合物以2-苯基色原酮为基本母核，结构中存在较多的酚羟基和羰基，具有较好的还原性，常被用于自由基清除的抗氧化性研究[3]，如张丽君等[4]研究发现石榴皮黄酮对DPPH 自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）与超氧阴离子自由基的清除作用优于Vc；米智等[5]研究表明黄花菜黄酮对DPPH·与ABTS 自由基均有较强的清除作用。由于目前暂未公开报道天门冬黄酮类化合物的提取工艺及抗氧化活性，而超声波辅助提取法操作简便、快速，提取效率较高，可避免高温对活性成分的破坏，已被广泛用于天然产物的提取分离[6，7]。因此，本研究通过单因素与正交实验优化天门冬黄酮化合物的最佳超声提取工艺条件后，采用体外实验评价该黄酮提取物的抗氧化活性，以期为天门冬资源的开发与利用提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

天门冬干燥块茎购于成都药材批发市场；芦丁标准品（92.2% 中国药品生物制品检定所）；水杨酸、FeSO4、H2O2、Al（OH）3、NaNO2、NaOH、无水乙醇、三（羟甲基）氨基甲烷，均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、Vc，均为分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2 型数显恒温水浴锅（常州金坛宏华仪器厂）；ME204E 型电子分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；KQ-600KDB 型超声波清洗机（昆山超声仪器有限公司）；L550 型低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；RE-52A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FD-1B-50 型冷冻干燥器（江苏天翎仪器有限公司）；722 型紫外-可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 天门冬黄酮提取操作 将干燥的天门冬块根完全粉碎后，过60 目筛，准确称取一定质量的天门冬粉末置于一定浓度与体积的乙醇溶液中，在适宜的温度下于80W 的超声功率中提取一段时间后，测定提取产物中黄酮含量。

1.3.2 标准曲线绘制 采用亚硝酸钠-硝酸铝法测定提取产物中黄酮含量[8]，具体如下：准确称取一定质量的芦丁标准品，配制成0.1mg·mL-1芦丁标准储备液后，精密量取1、2、3、5、6 mL 至10mL 容量瓶内，各加入5%NaNO20.2mL 静置5min 后，再加入10%Al（NO3）30.2mL，静置5min 后，继续加入4%NaOH 溶液2mL 摇匀，再加入蒸馏水定容摇匀。以试剂空白作参比溶液，于508nm 波长测定吸光度，并以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，该回归方程为Y=12.51X+0.05，r = 0.9995，表明在0.01~0.06mg·mL-1范围内，吸光度值与浓度呈良好的线性关系。按照上述实验条件，测定不同提取物的吸光度后，根据回归方程测得不同样品的黄酮含量。

黄酮含量/%=C×V×D/W×100%（1）式中 C：待测样品溶液的黄酮浓度，mg·mL-1；D：稀释倍数；V：样品溶液体积，mL；W：待测样品的质量，mg。

1.3.3 提取工艺条件

1.3.3.1 料液比 根据预实验结果，固定提取溶剂浓度为75%、提取温度为45℃、提取时间为2.5h，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50（g∶mL）对提取物中黄酮含量的影响。

1.3.3.2 提取溶剂浓度 根据预实验结果，固定料液比为1∶30（g∶mL）、提取温度为45℃、提取时间为2.5h，考察提取溶剂乙醇浓度55%、65%、75%、85%和95%对提取物中黄酮含量的影响。

1.3.3.3 提取温度 根据预实验结果，固定料液比为1∶30（g∶mL）、提取溶剂浓度为75%、提取时间为2.5h，考察提取温度为25、35、45、55 和65℃对提取物中黄酮含量的影响。

1.3.3.4 提取时间 根据预实验结果，固定料液比为1∶30（g∶mL）、提取溶剂浓度为75%、提取温度为45℃，考察提取时间为1.5、2、2.5、3、3.5h 对提取物中黄酮含量的影响。

1.3.4 正交实验设计 基于单因素实验结果，设计四因素三水平正交实验以确定超声辅助提取天门冬黄酮类化合物的最佳工艺条件，具体考察因素与水平见表1。

表1 正交实验因素与水平Tab．1 Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH·清除率的测定 采用75%乙醇溶液配制不同浓度的天门冬黄酮提取液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg·mL-1） 后，分别向5 支试管中各加入1.0mL，另外每支各加入0.2mmol·L-1DPPH 溶液2mL，再加入2mL 无水乙醇，混匀后置于暗处30min后，于517nm 处测定溶液吸光度，记为As，另用蒸馏水代替DPPH·溶液，同法操作，测得的吸光度记为A0，同时以去离子水代替样品，同法操作，测得的吸光度记为Ab，通过式（2）计算不同物质对DPPH·的清除率。所有结果均平行测定3 次，另以VC作阳性对照，并比较不同物质对DPPH·的半数清除率（IC50）[9]。

1.3.5.2 ·OH 清除率的测定 移取上述相同5 种质量浓度的天门冬黄酮提取液各1.0mL 分别至5 支试管中，另加入9mmol·L-1FeSO4溶液1mL 和9mmol·L-1水杨酸乙醇溶液1mL，混匀后继续加入8.8mmol·L-1H2O21.0mL，置于35℃反应30min 后，于510nm 处测定溶液吸光度，记为As。另用蒸馏水代替H2O2，同法操作，测得的吸光度记为A0，同时以去离子水代替样品，同法操作，测得的吸光度记为Ab，通过式（2）计算不同物质对·OH 的清除率。所有结果均平行测定3 次，另以VC作阳性对照，并比较不同物质对·OH的半数清除率（IC50）[10]。

2 结果与讨论

2.1 料液比对提取物中黄酮含量的影响

图1为不同料液比对提取物中黄酮含量的影响。

图1 料液比对提取物中总黄酮含量的影响Fig.1 Effect of solid - liquid ratio on content of total flavonoids in extract

由图1 可见，随着料液比的提高，提取物中黄酮的含量先增大后减小，当料液比为1∶30（g∶mL）时，提取物中黄酮含量达到最大值。提取溶剂用量的增多，有助于天门冬中黄酮化合物游离至提取溶液内，但随着提取溶剂用量的继续增多，溶于乙醇的其它组分也易游离至溶剂内。因此，选择料液比1∶20、1∶30、1∶40（g∶mL）作为正交实验因素考察水平。

2.2 乙醇浓度对提取物中黄酮含量的影响

图2为不同乙醇浓度对提取物中黄酮含量的影响。

图2 乙醇浓度对提取物中总黄酮含量的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids in extract

由图2 可见，随着提取溶剂乙醇浓度的增大，提取产物中黄酮的含量先增大后减小，当乙醇浓度达到75%时，提取物中黄酮含量达到最高值。这可能归因于乙醇浓度越高，提取溶剂的极性越小，而天门冬黄酮的化学结构中存在较多的酚羟基，具有一定的极性，若乙醇溶度过高，一方面黄酮化合物难以溶出，另一方面其它脂溶性杂质的游离量增多，造成产物中黄酮的含量下降。因此，选择乙醇浓度65%、75%和85%作为正交实验因素考察水平。

2.3 超声温度对提取物中黄酮含量的影响

图3为超声温度对提取物中黄酮含量的影响。

图3 超声温度对提取物中总黄酮含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on content of total flavonoids in extract

由图3 可见，提取物中黄酮含量随着温度的升高逐渐增大，在45℃后呈下降趋势。超声温度越高使得溶液体系中分子运动越剧烈，从而可增强黄酮化合物与溶剂的相互作用程度，进而有利于其游离至溶剂内，但温度过高，可能会造成天门冬黄酮类化合物的氧化或分解，从而使得其含量下降。为此，选择超声提取温度35、45 和55℃作为正交实验因素考察水平。

2.4 超声时间对提取物中黄酮含量的影响

图4为超声时间对提取物中黄酮含量的影响。

图4 超声时间对提取物中总黄酮含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on content of total flavonoids in extract

由图4 可见，在1.5 ~ 2.5 h 内，提取物中黄酮含量随着超声时间的延长而增大，当超声时间延长至2.5h 时，提取物中黄酮含量达到最高，随后逐渐降低。较长的超声时间不仅容易产生热效应，致使黄酮类物质发生氧化或分解反应而被破坏，同时可使提取物中的不溶物、黏液质等杂质游离至提取液中，从而降低提取物中黄酮的含量[11]，因此，选择提取时间2、2.5、3h 作为正交实验因素考察水平。

2.5 正交实验结果

采用正交实验优化超声辅助提取天门冬黄酮的提取条件，结果与分析见表2。

表2 正交实验结果Tab．2 Results of orthogonal experiment

由表2 可见，3 个因素对提取物中黄酮含量的影响顺序依次为乙醇浓度>超声时间>料液比>超声温度，确定的最佳组合均为A2B3C1D3，即料液比为1∶30（g∶mL），乙醇浓度为85%，超声温度为35℃，超声时间为3h。在该最佳提取条件下，提取物中黄酮含量为10.6%，均高于正交实验各实验组结果。

2.6 抗氧化活性

2.6.1 天门冬黄酮提取物对DPPH·的清除作用

图5为不同物质对DPPH·的清除作用比较。

图5 不同物质对DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of DPPH·on different sample

由图5 可见，随着天门冬黄酮提取物浓度的增大，DPPH·的清除率逐渐升高，IC50值为1.04mg·mL-1，表明天门冬黄酮提取物具有一定清除DPPH·的能力。这归因于黄酮类化合物的抗氧化能力与其结构中酚羟基的数量有关，而天门冬黄酮类化合物以5,7-二羟基-6,8,4-三甲氧基黄酮为主，具有的酚羟基数量较多[12]，因此，具有良好的抗氧化活性。

2.6.2 天门冬黄酮提取物对·OH 的清除作用

图6为不同物质对·OH 的清除作用比较。

图6 不同物质对·OH 的清除作用Fig.6 Scavenging effect of·OH on different sample

由图6 可见，随着天门冬黄酮提取物浓度的增大，其对·OH 的清除率越来越高，IC50值为1.18mg·mL-1，表明天门冬黄酮提取物对·OH 具有一定的清除作用。由于天门冬黄酮类化合物的化学结构中存在邻二酚羟基结构，可与·OH 形成稳定的半醌式自由基结构，能够终止自由基链式反应的进行[13]，从而表现出良好的清除能力。

3 结论

本研究以天门冬作为提取原料，利用超声辅助法提取其黄酮类化合物。通过单因素与正交实验确定该提取工艺最佳条件为：料液比为1∶30（g∶mL），乙醇浓度为85%，超声温度为35℃，超声时间为3h，总黄酮提取率可达10.6%，另外发现该黄酮提取物对DPPH·与·OH 的IC50分别为1.04mg·mL-1与1.18mg·mL-1，表明其具有良好的DPPH·与·OH 清除能力。该实验结果可为天门冬黄酮化合物的提取及后续相关资源的开发与利用提供参考与借鉴。