KIF21B在肾细胞癌中的表达及其对肾癌细胞786-O凋亡的调控作用研究

侯 骁,苟 欣

(重庆医科大学附属第一医院泌尿外科 400016)

肾细胞癌是泌尿系统肿瘤患者的第二大死因[1],局部或早期肾细胞癌可通过手术治疗[2]。虽然肾细胞癌早期诊断率不断提高,但仍有20%～30%的肾细胞癌患者在初次治疗期间存在远处转移迹象[3]。晚期肾细胞癌的5年生存率极低,主要原因是对放疗和化疗的抵抗[4]。阐明肾细胞癌的发病机制,寻找有效的治疗方法已成为当务之急。

肌动蛋白家族成员21B(kinesin family member 21B,KIF21B)属于驱动蛋白超家族[5]。人类驱动蛋白分为14个家族,由45种不同的驱动蛋白组成,参与一系列细胞过程,如有丝分裂、运动、细胞器转运和肿瘤发展[6]。研究证实,KIF21B在包括神经元在内的多种类型细胞中表达[7]。然而,关于KIF21B蛋白与人类肿瘤关系的研究较少[8-9]。KIF21B在癌症,尤其是肾细胞癌中的功能和调控机制,及其对预后的影响尚未得到广泛研究。因此,本研究观察了肾细胞癌组织和肾癌细胞株中KIF21B相对于癌旁组织和人胚肾细胞的表达差异,进一步研究了KIF21B对肾癌细胞786-O凋亡的调节作用及其分子机制,为肾细胞癌早期诊断及靶向治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床组织

所有肾细胞癌组织和相应的癌旁组织来自本院2020年4月至2021年8月接受肾癌根治性切除/部分切除术患者。所有患者均为初发病例且在手术前未进行放化疗,术后经病理诊断确诊肾透明细胞癌。所有患者均签署知情同意书,所有试验均获得本院伦理委员会的批准与监督[批号:2023年科研伦理(2023-18)]。

1.1.2细胞

人胚肾细胞HEK293和人肾癌细胞株786-O、ACHN、A498和Caki-1购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.3主要仪器与试剂

多聚甲醛、Triton X-100、DAPI购于上海碧云天生物技术有限公司;RPMI-1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司;青霉素、链霉素、山羊血清、RIPA裂解液、中性树脂、DAB染色试剂盒、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)购于上海碧云天生物技术有限公司;KIF21B沉默慢病毒、阴性对照慢病毒购于上海吉凯基因医学科技股份有限公司;Tunel凋亡试剂盒、BCA蛋白浓度试剂盒、凝胶试剂盒、增强化学发光(enhanced chemiluminescence,ECL)试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司;聚偏二氟乙烯膜购于美国Millipore公司;KIF21B抗体(PA5-45832)购于赛默飞生物制药(杭州)有限公司;磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抗体(WL02849)、蛋白激酶B(AKT)抗体(WL0003b)、Bcl-2抗体(WL01556)、Bax抗体(WL01637)、Actin抗体(WL0002d)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗(WLA023)购于沈阳万类生物科技有限公司;p-PI3K抗体(#17366)、p-AKT抗体(#4060)购于美国Cell Signaling Technology公司。凝胶扫描仪购于美国Bio-Rad公司;流式细胞仪购于美国BD公司;LightCycler 480定量聚合酶链式反应(PCR)仪购于美国Roche公司;倒置相差显微镜购于日本Olympus公司;荧光显微镜购于日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组织化学

新鲜组织标本采用10%甲醛固定和石蜡包埋切片后备用。5 μm石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水后采用热处理法进行抗原修复,采用枸橼酸盐缓冲液100 ℃水浴15 min。采用3%过氧化氢水溶液浸泡切片15 min以阻断内源性过氧化物酶,使用含10%山羊血清的PBS封闭切片。在4 ℃下孵育一抗稀释液(KIF21B,1∶500稀释)过夜,随后在37 ℃下孵育二抗60 min,室温下行DAB染色,苏木素复染2 min,梯度脱水和透明后中性树脂封片。

随机选择5个高倍视野,计算染色细胞的百分比及染色程度,量化评分后取平均值。染色细胞所占百分比:无染色细胞(0分),>0～25%(1分),>25%～50%(2分),>50%～75%(3分)和>75%～100%(4分)。染色程度:无染色(0分),浅棕色(1分),棕黄色(2分)和深棕色(3分)。最终得分为上述两个评分相乘:0分为阴性(-);>0～3分为弱阳性(+);>3～6分为阳性(++);>6～12分为强阳性(+++)。

1.2.2蛋白印迹法(Western blot)

采用RIPA裂解液冰上裂解待测组织或细胞,离心提取并收集待测样本总蛋白。根据BCA试剂盒操作说明书对总蛋白浓度进行定量分析。按照80 μg上样量计算待测样品的上样体积。按照试验步骤进行电泳,先80 V电泳45 min,再120 V电泳120 min。250 mA转膜120 min后室温封闭120 min。随后4 ℃下一抗孵育过夜,PBST洗膜10 min 3次。室温下二抗稀释液孵育120 min,PBST洗膜10 min 3次。最后采用ECL显影曝光,Image J图像分析系统对蛋白条带进行分析。

1.2.3细胞培养

所有细胞使用含10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基培养于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱,每两天更换培养基、传达培养。

1.2.4细胞转染

人KIF21B特异性短发夹RNA(shRNA)序列(GGAGCTGATGGAGTATAAG)和阴性对照序列(TTCTCCGAACGTGCACGT)购于上海吉凯基因医学科技股份有限公司。根据试剂说明书,shKIF21B组细胞转染沉默慢病毒,Negative control组细胞转染空载体慢病毒,Blank control组细胞不做处理,感染复数(MOI)为20。在37 ℃、5% CO2的培养箱中连续培养12 h后更换完全培养基继续培养72 h。

1.2.5Tunel

将转染好且生长状态良好的各组细胞种至6孔板,5×104个细胞/孔。待细胞贴壁后,弃培养基并用PBS润洗细胞10 min 3次,4%多聚甲醛室温固定细胞30 min,Triton X-100孵育5 min,PBS润洗10 min。然后,根据Tunel凋亡试剂盒操作说明制备Tunel测试溶液,每孔加入Tunel测试溶液50 mL,37 ℃孵箱避光孵育60 min。弃掉Tunel测试溶液后使用DAPI室温避光孵育10 min染色细胞核,在荧光显微镜下观察细胞核和Tunel阳性细胞,并计算5个随机视野的阳性率(Tunel/DAPI)。

1.2.6流式细胞术

将转染好且生长状态良好的各组细胞种至6孔板,每孔1×106个细胞。待细胞铺满6孔板后,0.25%胰酶消化、离心并用PBS重悬细胞。根据细胞凋亡试剂盒操作说明,分别用膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)双染细胞,4 ℃避光孵育15 min。随后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 KIF21B在肾细胞癌组织及肾癌细胞株中表达情况

为明确KIF21B在肾细胞癌组织中的表达情况,采用免疫组织化学染色和Western blot比较KIF21B在肾细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达情况,结果显示KIF21B在肾细胞癌组织中表达水平明显高于癌旁组织。采用Western blot检测KIF21B在肾癌细胞株中的表达情况。和人胚肾细胞HEK293比较,人肾癌细胞株786-O、ACHN、A498和Caki-1中KIF21B蛋白呈不同程度上调,见图1。52例肾癌组织中KIF21B阳性表达率为82.7%,高于18例癌旁组织中KIF21B阳性表达率(16.7%),差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 KIF21B在不同组织中表达水平

A:肾细胞癌组织与相应癌旁组织免疫组织化学染色图(100×);B.肾细胞癌组织与相应癌旁组织中KIF21B相对表达水平;C、D:肾癌细胞系786-O、ACHN、A498、Caki-1与人胚肾细胞HEK293中KIF21B相对表达水平;a:P<0.05,与其他细胞株两两比较。图1 肾细胞癌组织及肾癌细胞系中KIF21B相对表达水平

2.2 KIF21B表达水平与临床病理特征的关系

为了进一步确认KIF21B的表达水平与患者临床资料的相关性,通过免疫组织化学结果量化评分,分析KIF21B在肾癌组织中表达水平与患者临床病理特征之间的关系,结果显示,KIF21B在肾癌组织中的表达水平与肿瘤Furhman分期、T分期和肿瘤是否远端转移相关(P<0.05),与患者性别、年龄无关(P>0.05),见表2。

2.3 KIF21B对肾癌细胞凋亡的影响

为研究KIF21B在肾癌中的作用,选取相对表达水平最高的786-O细胞株进一步试验。慢病毒转染786-O细胞72 h后,Western blot结果显示,沉默组786-O中KIF21B表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,但两个对照组之间KIF21B表达比较无明显差异(P>0.05)。进一步研究KIF21B对786-O细胞凋亡的影响,采用Tunel和流式细胞术试验,结果显示沉默组786-O细胞凋亡水平明显上调,但两个对照组之间细胞增殖和凋亡水平比较无明显差异(P>0.05),见图2。

A、B:肾癌786-O细胞KIF21B相对表达水平;C:Tunel及FCM试验显示各组细胞凋亡水平;Bar=100 μm;a:P<0.05,与空白对照组、阴性对照组比较。图2 KIF21B对肾癌细胞786-O凋亡的影响

2.4 KIF21B沉默介导PI3K/AKT信号通路的抑制

为研究KIF21B对肾细胞癌细胞生物学行为的影响机制,采用Western blot检测PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达水平。结果显示,与阴性对照组比较,沉默组PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表达被明显抑制。对沉默组使用PI3K/AKT通路激动剂IGF1,进一步采用Western blot检测,结果显示,p-PI3K、p-AKT表达上调,且促凋亡蛋白Bax表达降低,而抑制凋亡蛋白Bcl-2表达上调,见图3。

a:P<0.05。图3 PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平

3 讨 论

临床上,超过1/3的肾细胞癌患者在最初诊断时会出现转移,出现转移的肾细胞癌与高致死率密切相关[10-11]。尽管治疗转移性肾癌的酪氨酸激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂药物已完成开发,但肾细胞癌患者的预后仍然较差,5年生存率低于10%[12]。因此,有必要阐明肾癌的发病机制,寻找新的治疗靶点。

驱动蛋白与动力蛋白分子形成复合物参与细胞内囊泡和细胞器的运输[8]。然而,驱动蛋白的过度表达会导致纺锤体塌陷和单极纺锤形成,导致后期遗传物质分布不均匀,形成非整倍体。非整倍体细胞中获得或丢失的遗传物质被认为是引发癌症恶性进展的因素[13]。因此,研究认为驱动蛋白的异常表达与肿瘤发展具有相关性[14-15]。此前,研究人员发现KIF21B基因多态性与多发性硬化症、强直性脊柱炎、克罗恩病和溃疡性结肠炎有关[9],且KIF21B的过度表达加速了神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和多发性硬化症)的进展,KIF21B参与兴奋性突触传递,沉默KIF21B的表达会抑制其功能并影响其生物学行为[16-17]。而关于KIF21B对人类肿瘤调控的作用研究非常有限,缺乏KIF21B在人肾细胞癌中的表达及其相关性机制的报道。鉴于驱动蛋白可以广泛参与肿瘤的发生、发展,因此本研究旨在探究KIF21B是否会对肾细胞癌产生调控作用。

为确定KIF21B在肾细胞癌中的表达情况,本研究收集临床手术切除的肾细胞癌组织及相应癌旁组织,对肾细胞癌患者肿瘤组织和癌旁组织进行免疫组织化学和Western blot检测,结果显示,KIF21B在肾细胞癌及癌旁组织中均有表达。但是相对于癌旁组织,癌组织中的KIF21B呈高表达状态。随后,本研究进行了体外试验,以人胚肾细胞为对照,Western blot检测KIF21B在肾癌细胞系786-O、ACHN、A498、Caki-1中的表达情况。与组织实验的结果类似,KIF21B在肾癌细胞系中呈明显高表达,且以786-O细胞株为著,表明KIF21B在肾细胞癌中可能是一种致癌基因。

在敲降786-O中的KIF21B后,在培养细胞的过程中可观察到细胞增殖减慢且细胞死亡增加。进一步研究敲降KIF21B后786-O细胞的凋亡水平,结果提示,KIF21B对肾癌细胞786-O的凋亡具有调控作用,低表达的KIF21B可以明显促进786-O的凋亡。

不同的信号通路可以调节不同的生命活动和细胞行为。PI3K/AKT是一个重要的细胞信号通路,由PI3K及其下游分子丝氨酸/苏氨酸AKT构成[18]。通路的激活和磷酸化为PI3K转位到膜提供锚定位点,从而参与各种细胞外基质分子和细胞因子的转导[19]。该信号通路对细胞也具有重要的生物学作用,广泛参与各种生理过程[20]。另一方面,PI3K/AKT信号通路也是癌症中最常见的失调通路之一[21]。PI3K/AKT通路已成为治疗癌症药物开发的主要焦点[22],PI3K/AKT信号通路已被证明参与驱动蛋白对肿瘤的调控[23-24]。因此,作者猜想PI3K/AKT可能在KIF21B对肾癌细胞凋亡的调控中发挥作用。通过Western blot检测敲降KIF21B后786-O细胞中PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达水平,结果证实低表达的KIF21B可以抑制786-O中PI3K/AKT信号通路关键蛋白的表达,表明KIF21B可能通过PI3K/AKT信号通路调节肾细胞癌的凋亡。

综上所述,KIF21B作为致癌基因在肾细胞癌和肾癌细胞中高表达,提示KIF21B在肾细胞癌的发生、发展过程中作为癌基因被异常激活。敲降KIF21B后,肾癌细胞786-O的凋亡明显增加,表明KIF21B可以调控肾癌细胞的凋亡并调控肾癌细胞的发生、发展。另一方面,KIF21B对肾癌细胞凋亡的调控可能与PI3K/AKT有关。此外,KIF21B表达水平与肾细胞癌的临床分期分级和预后是否存在相关性,以及KIF21B对肾癌细胞的其他生物学行为是否有调控作用及其具体的调控机制,还有待进一步研究。