肾结石患者肾乳头组织中LINC01197及相关因子的表达研究

林谦，倪建华，耿志海，朱江波，章庆华，郑森中

·论 著·

肾结石患者肾乳头组织中LINC01197及相关因子的表达研究

林谦，倪建华，耿志海，朱江波，章庆华，郑森中

台州市第一人民医院泌尿外科，浙江台州 318020

探讨肾结石患者肾乳头组织中LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1的表达特点及相关性。选取2021年3月至2023年3月台州市第一人民医院收治的经皮肾镜碎石术治疗的30例草酸钙肾结石患者作为结石组，选取同期行根治性肾切除术（术后均由病理科诊断为透明细胞癌）的30例肾肿瘤患者作为对照组。结石组于术中直视下活检肾乳头及其周围间质组织，对照组收集远离肿瘤（2cm以上）的正常肾乳头组织样本，经病理学诊断后确诊为正常肾乳头组织。检测、比较两组肾乳头组织内LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表达水平，分析LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3之间的相关性。与对照组相比，结石组的肾乳头组织呈现LINC01197和SIRT3低表达、miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1高表达，差异均有统计学意义（<0.05）。Spearman相关性分析显示LINC01197与miR-516b-5p呈显著负相关（=–0.751，<0.05），LINC01197与SIRT3呈显著正相关（=0.813，<0.05），miR-516b-5p与SIRT3呈显著负相关（=–0.528，<0.05）。LINC01197 在肾结石病理进展中具有潜在价值，其参与调节肾结石的发展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1 有关。

长链非编码RNA；LINC01197；miR-516b-5p；FoxO1；肾结石

长链非编码RNA（long-non coding RNA，lncRNA）在多层面参与调控基因的表达，影响机体的病理和生理过程，在细胞增殖、分化、凋亡中发挥重要作用[1]。近年来研究发现，在肾结石患者、肾结石动物模型或细胞模型中存在大量lncRNA异常表达[2-3]。LINC01197是被发现的lncRNA之一，其位于15q26.2，长度为1445个碱基，可能在肾结石病理进展中具有重要的研究价值。本研究采用分子生物学方法，检测肾结石肾乳头组织内LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1、Ac-FoxO1表达水平，初步探讨了肾结石患者肾乳头组织中LINC01197及相关因子的表达特点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年3月至2023年3月台州市第一人民医院收治的经皮肾镜碎石术治疗的30例草酸钙肾结石患者作为结石组，选取同期行根治性肾切除术（术后均由病理科诊断为透明细胞癌）的30例肾肿瘤患者作为对照组。结石组于术中直视下活检肾乳头及其周围间质组织，对照组收集远离肿瘤（2cm以上）的正常肾乳头组织样本，经病理学诊断后确诊为正常肾乳头组织。结石组纳入标准：①术后结石标本经红外光谱自动分析系统分析结石成分主要为草酸钙；②无痛风、冠心病、糖尿病、自身免疫性疾病、甲状旁腺功能亢进等疾病；对照组纳入标准：①所选病例无高尿酸血症、糖尿病、泌尿系感染等其他的代谢性疾病；②患者既往无泌尿系结石病史；③年龄与结石组患者匹配。排除标准：有尿酸结石、感染性结石和胱氨酸结石等疾病。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（>0.05），具有可比性。本研究经台州市第一人民医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：台一医伦审2022研第114号01），患者及家属签署知情同意书。

1.2 主要试剂

TRIzol试剂盒（上海Absin公司，货号：abs9331）；放射免疫沉淀法裂解缓冲液（上海泽叶生物公司，货号：ZY131006）；化学发光检测试剂盒（上海Absin公司，货号：abs920）；iScript cDNA合成试剂盒（中国Bio-Rad公司，货号1708890）；SYBR Green 实时荧光定量 PCR 预混液试剂盒（北京Solarbio公司，货号：QPK-201）；胎牛血清（美国Hyclone公司，货号：SH30396.03），含双抗的PBS液（美国Hyclone公司，货号：SH30256．01）；定量反转录PCR试剂盒（北京Takara公司，货号：RR430B）。

1.3 方法

1.3.1 定量反转录PCR 采用定量反转录PCR检测肾结石肾乳头组织内LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表达水平。应用TRIzol试剂分离组织或细胞中的总RNA；使用iScript cDNA合成试剂盒进行反转录反应合成cDNA；应用SYBR Green实时荧光定量PCR预混液试剂进行cDNA扩增。所有实验均按照试剂或试剂盒说明书进行，引物序列见表1。

表1 反转录-聚合酶链反应引物序列

1.3.2 蛋白质免疫印迹法 采用蛋白质免疫印迹法检测肾结石肾乳头组织内SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1蛋白表达水平。应用放射免疫沉淀法裂解缓冲液收集组织或细胞内的总蛋白，20μg等量蛋白质上样，经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将总蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上；再经5%脱脂奶粉室温孵育聚偏二氟乙烯膜2h，4℃过夜孵育一抗抗体，室温孵育二抗抗体2h。应用化学发光底物试剂盒显示蛋白条带并进行定量分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 肾结石成分分析

肾结石标本留取后进行红外光谱分析，显示结石的主要成分为草酸钙，见图1。

图1 结石成分红外光谱图

2.2 两组肾乳头组织LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3、Ac-FoxO1/FoxO1表达水平比较

与对照组相比，结石组的LINC01197和SIRT3表达减低，miR-516b-5p和Ac-FoxO1/FoxO1表达升高，差异均有统计学意义（<0.05），见图2～5。蛋白质免疫印迹法检测显示，两组肾乳头组织中SIRT3表达减弱，Ac-FoxO1和FoxO1表达增高，见图6。

2.3 LINC01197、miR-516b-5p、SIRT3的相关性分析

LINC01197与miR-516b-5p呈负相关（= –0.751，<0.01），LINC01197与SIRT3呈正相关（=0.813，<0.01），miR-516b-5p与SIRT3呈负相关（= –0.528，<0.05），见图7～9。

图2 两组肾乳头组织LINC01197表达水平比较

注：<0.05

图3 两组肾乳头组织miR-516b-5p表达水平比较

注：<0.05

图4 两组肾乳头组织SIRT3表达水平比较

注：<0.05

图5 两组肾乳头组织Ac-FoxO1/FoxO1表达水平比较

注：<0.05

图6 SIRT3、FoxO1和Ac-FoxO1蛋白表达

图7 LINC01197与miR-516b-5p相关性

图8 LINC01197与SIRT3相关性

图9 SIRT3与miR-516b-5p相关性

3 讨论

肾结石与晚期肾衰竭发生的风险密切相关，对人类的生命和公共健康已构成了巨大的威胁，研究显示肾结石可能是一种与代谢综合征密切相关的系统性疾病[4]。肾结石的化学成分取决于各种化学物质在尿液中的异常情况，根据结石的形状、大小和化学成分的不同，肾结石可分为5种类型，其中含钙结石是肾结石的主要类型，约占所有尿路结石的80%，由草酸钙组成的钙结石占比高达50%，是钙结石的主要成分[5]，但肾结石形成的确切分子机制尚不清楚。

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在转录、转录后及翻译水平上参与调节基因的表达，已被证实在肿瘤发展中有关键作用[6-7]。有研究显示，与健康对照组相比，肾结石患者、肾结石动物模型或细胞模型中存在大量lncRNA异常表达。Liang等[2]研究结果显示，与健康个体相比，在草酸钙结石患者的尿液中存在上千个异常表达的lncRNA，对其中6个lncRNAs 进行进一步研究发现，这些lncRNAs参与尿路结石的形成。LINC01197作为非编码RNA，由1445个碱基组成，已被证明可以有效地调控肿瘤细胞的增殖、侵袭与迁移，同时可以有效地抑制类风湿关节炎患者病灶局部炎症进展[8-9]，但其在肾结石的形成机制方面尚不清楚。

本研究结果显示，在结石组患者的肾乳头中观察到LINC01197、SIRT3 低表达，miR-516b-5p、Ac-FoxO1/FoxO1高表达。miR-516b-5p与LINC01197存在结合位点[10]，本研究结果显示miR-516b-5p与LINC01197表达呈显著负相关，miR-516b-5p与SIRT3表达呈显著负相关。SIRT3是一类保守的蛋白家族，具有DNA+依赖性蛋白脱乙酰基酶活性，可介导生物体对多种胁迫的适应性反应；同时，SIRT3作为线粒体基质中的主要脱乙酰基酶，在减少活性氧产生及缓解线粒体功能障碍中也起着至关重要的作用[10-11]。有研究表明，SIRT3在肾结石病理条件下表达下调，而在体外实验中上调SIRT3能够有效的抑制肾结石进展[12-13]。SIRT3可通过诱导FoxO1去乙酰化和促进巨噬细胞M2极化，抑制肾脏草酸钙晶体的形成。本研究结果显示，结石组的Ac-FoxO1/FoxO1表达增高，跟SIRT3表达升高呈一致性，充分证实了以上结论。

综上所述，LINC01197在肾结石病理进展中的作用具有重要的潜在价值，其参与调节肾结石的发生发展可能跟miR-516b-5p、SIRT3、FoxO1关系密切。未来需进行更多的研究来进一步明确其作用机制。

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Expression of LINC01197 and related factors in renal papillary tissues from patients with kidney stones

Department of Urology, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou 318020, Zhejiang, China

To investigate the expression and correlation of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1 and Ac-FoxO1 in renal papillary tissues of patients with kidney stones.A total of 30 patients with calcium oxalate kidney stones treated by percutaneous nephrolithotripsy admitted to the Taizhou First People’s Hospital from March 2021 to March 2023 were selected as the stone group, and a total of 30 patients with renal tumors who underwent radical nephrectomy (all of whom were diagnosed as clear-cell carcinoma by pathology after the operation) during the same period were selected as the control group. In the stone group, the renal papilla and its surrounding mesenchymal tissues were biopsied under intraoperative direct vision, while in the control group, samples of normal renal papilla tissues far away from the tumor (more than 2cm) were collected, and the diagnosis of normal renal papilla tissues was confirmed after pathological diagnosis. The expression levels of LINC01197, miR-516b-5p, SIRT3, FoxO1, and Ac-FoxO1 were detected and compared in the renal papilla tissues of the two groups, and the correlation between LINC01197, miR-516b-5p, and SIRT3 was analyzed.Compared with the control group, the renal papilla tissues of the stone group showed low expression of LINC01197 and SIRT3, and high expression of miR-516b-5p and Ac-FoxO1/FoxO1, all of which were statistically significant (<0.05). Spearman’s correlation analysis showed a significant negative correlation between LINC01197 and miR-516b-5p (=–0.751,<0.05), LINC01197 was significantly positively correlated with SIRT3 (=0.813,<0.05), and miR-516b-5p was significantly negatively correlated with SIRT3 (=–0.528,<0.05).LINC01197 has potential value in the pathological progression of kidney stones, and its participation in regulating the development of kidney stones may be related to miR-516b-5p, SIRT3 and FoxO1.

Long non-coding RNA; LINC01197; MiR-516b-5p; FoxO1; Kidney stone

R692.4

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.23.008

（2023–03–11）

（2023–03–22）

台州市社会科技发展计划项目（21ywa46）

林谦，电子信箱：linqian_2004@163.com