益生菌制剂在水产养殖中的应用

■ 瞿 彬 徐文昌 宋雪琳 孟天靓，2 张 赫，2*

（1.江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013；2.江西省生物加工过程重点实验室，江西南昌 330013）

近些年世界人口密度不断增大，人们日常生活对水产品需求不断增加，促使全国各地的水产养殖密度逐年提高，人工饲料的投入量也随之增大。这种养殖模式和饲喂行为会逐渐削弱水产动物的免疫系统进而引发水产动物一系列肠道和皮肤疾病等多方面的问题，进而严重影响水产养殖的效率[1-3]。面对这种不良影响，人们通过使用抗生素抑制水体病原微生物来缓解水疫的发生，但是长期使用抗生素又引发了药物残留污染、新型耐药菌出现、水产动物免疫力降低等一系列问题[4-5]。这就迫使人们寻找其他高效且绿色的养殖技术，从此益生菌辅助养殖技术开始进入人们的视野。许多科学证据表明益生菌的添加能够显著提高水产养殖效率[6-9]。有学者发现使用益生菌可以有效降低因颗粒饲料引起的鳜鱼存活率降低的问题[10]。益生菌能分解水体中的有害物质，且益生菌本身进入水产动物能够产生一定的抑菌作用，使用益生菌制剂可以缓解高密度养殖带来的不利影响，且避免了抗生素滥用造成的环境污染问题[11-13]。近年来的研究还发现，益生菌制剂不仅具有抑制病原菌的作用，还能改善水产动物肠道微生物群落、刺激水产动物免疫系统、参与降解水体中有害物质[14]。大量科研实践已经证实益生菌在水产养殖业中发挥着积极作用，其规模化的应用将极大促进水产养殖业的绿色、可持续发展。

目前，水产品养殖过程中益生菌制剂运用越来越普遍。研究人员也在持续开发新的水产养殖益生菌或者多种益生菌的混合制剂，同时，我们对于益生菌促进水产养殖的机理认识也在不断加深。以求益生菌辅助养殖技术的进步和规模化应用。

1 水产养殖益生菌

1.1 水产养殖益生菌

益生菌是指通过生活环境、一些被捕食动植物或者饲料进入生物体肠道内的一定数目的对机体健康有益的微生物，它能够促进和调节肠道内部的微生物生态的平衡[15-16]。由此可以看出在宿主通过一些途径摄入益生菌之后，益生菌可以给宿主带来一些有益的影响。考虑到现阶段水产养殖业遇到的水产动物免疫力下降、营养物质吸收能力下降等问题，益生菌的有益作用可以作为解决这方面问题的一种选择。因此，水产养殖益生菌是指能够对水产动物产生有益作用的微生物。

1.2 几种常见的水产养殖益生菌

1.2.1 芽孢杆菌（Bacillus）

芽孢杆菌是革兰氏阳性杆状细菌，属于厚壁菌门。目前添加在饲料中的常见芽孢杆菌有枯草芽孢杆菌、醋样芽孢杆菌等。几种芽孢杆菌中，枯草芽孢杆菌使用频率最高[6]。芽孢杆菌作为益生菌制剂成分时，其本身生理活动或代谢产物可以在水产动物的肠道中发挥有益作用，促进水产动物的生长发育、刺激水产动物的免疫系统从而提高免疫力[17-18]。或是生长活动中与其他病原微生物发生营养、能量竞争也能抑制病原菌的生长[19]。水产养殖环境中芽孢杆菌的快速生长可以提高水产养殖的产量，提升水产品抗病能力，能够缓解因过度养殖诱发的一系列水产动物疾病[20-21]。上述的生物活性效果使得芽孢杆菌成为水产动物饲料添加益生菌的理想菌种。

1.2.2 酵母菌（Saccharomyces）

酵母菌是一种常见的真核单细胞微生物，它与芽孢杆菌、乳酸菌这类没有完整细胞结构的微生物有很大不同。目前应用在水产饲料中的常见酵母菌种类有活性干酵母、酿酒酵母、饲料酵母等。当酵母菌添加至水产动物饲料中时，能够发挥抑制病原菌生长、增强鱼类免疫力、直接提供营养、促进营养物质吸收等有利于水产动物生长发育的作用。因酵母菌是兼性厌氧型菌，在通过水或者饲料进入水产动物的肠道内部之后，会进行有氧呼吸消耗水产动物肠道内的氧气，降低肠道内的含氧量从而抑制肠道内部好氧病原菌的生长[22]。也有学者发现在鱼类饲料中添加面包酵母（Bakers’yeast）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能够显著降低鱼类肠道细菌的数量并显著降低鱼类因嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）侵染导致的死亡数量，并由此推测合理利用面包酵母和酿酒酵母能够作为一种抗生素替代物运用于尼罗罗非鱼的养殖之中[11]。酵母菌作为真核生物有着富含β-葡聚糖的细胞壁，这类多糖物质能够刺激并大量激活水产动物网状内皮系统中的免疫细胞，从而强化水产动物的免疫系统、提高水产动物的免疫能力[23]。酵母菌本身无毒无害且能够发挥不错的生物学效果，又在常温下能够保持稳定的状态，非常适合工业化生产，这让酵母菌成为一个可供水产养殖业选择的优良菌种。

1.2.3 乳酸菌（Lactic acid bacteria）

乳酸菌是一类常见的厌氧或者兼性厌氧的细菌，可以将葡萄糖等糖类化合物在无氧条件下转化为乳酸。乳酸菌的分布十分广泛，它也是自然界动物以及人类肠道菌群中起着重要生理作用的菌种之一。将乳酸菌作为益生菌添加至水产动物的饲料中，乳酸菌能够促进营养物质的吸收、提升宿主免疫能力[24]。乳酸菌可以加强水产动物肠黏膜屏障功能从而提高水产动物免疫能力，还可以刺激水产动物黏膜，提高其体液免疫能力[13]。乳酸菌不仅能影响水产动物的免疫消化能力，还能够调节其肠道菌群结构，这表明乳酸菌也是一种适合水产养殖业饲料添加的益生菌菌种[25]。

1.3 复合益生菌对水产动物的影响

复合益生菌作为饲料饲喂水产动物时能够给水产动物带来有益影响[26-27]。例如将含有醋杆菌属（Acetobacter）、乳 酸 菌 属（Lactobacillus）和 假 单 胞 菌 属（Pseudomonas）的复合益生菌饲喂大菱鲆（Scophthalmus maximus），能提升其体内溶菌酶的活性，刺激白细胞的吞噬活力，显著提升其免疫能力[28]。将地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformisBL-2, BL-9）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBS-12）和乳酸菌（LactobacillusLB-1）组合制剂饲喂凡纳滨对虾，可以增强其对副溶血弧菌的抵抗能力，提高其存活率[29]。还有研究发现，由枯草芽孢杆菌Z2 和光合细菌（Rps Rutila）组合而成的复合益生菌在增强鲫鱼免疫指标方面有着显著效果[30]。这些研究说明了复合益生菌和单种益生菌一样可以通过增强水产动物免疫参数来提升水产动物免疫能力。此外，由芽孢杆菌（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacillus）参与组成的复合益生菌制剂对杂交鳢（Channa maculate ♀×C.argus ♂）生长起着积极的作用[9]，而芽孢杆菌（Bacillussp.BC26）分别与有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiaeC21）以及梅奇酵母（Metschnikowiasp.C14）的组合饲喂都能显著提升刺参（Apostichopus japonicus）的免疫学参数和消化能力[31]。这表明在饲料中添加复合益生菌，可以明显促进水产动物的生长。

单种益生菌和复合益生菌在提升水产动物免疫能力和促进水产动物生长方面发挥着相似的作用。在具体的生产活动中，需要探究复合益生菌和单种益生菌作为饲料添加时，哪种添加方式会更加有效。2012 年的一项研究指出，复合益生菌相较于单种益生菌并未表现出更好的水产养殖促进功效[32]。在某些情况下复合益生菌甚至会不如单种益生菌的促生长效果好。例如，有研究发现单一的枯草芽孢杆菌Z2 在提升鲫鱼生长性能以及改善鲫鱼肠道菌群环境这两方面的效果比复合益生菌要好[30]。综上所述，复合益生菌是有着改善水产动物生长状况和提升免疫能力的功效，但受到菌种、水产动物种类和环境等多种因素的影响，其与单一菌株相比未必会有优势。在实际生产中，就需要对比研究单一菌种或者复合菌种的应用效果之后，再选择其中优胜者作为饲料添加制剂。

2 益生菌促进水产养殖的机理

2.1 提高水产动物营养吸收能力

研究表明，许多益生菌在进入水产动物肠道后可以提升水产动物的营养吸收能力，促进水产动物生长[33-34]。例如，添加解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和短小芽孢杆菌（B.pumilus）能够在短期内提高尼罗罗非鱼的生长速率；单独添加Bacillus subtilis（ATCC 6633）也能明显提高尼罗罗非鱼的个体重量和存活几率[20-21，35]。乳酸菌也有相似的功能，王国霞等[25]发现添加嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）可以在一定程度提高凡纳滨对虾肠道、肝胰脏中淀粉酶和脂肪酶等多种消化酶的活性，从而提高凡纳滨对虾对营养物质的吸收能力。另外，酵母菌内含有许多水产动物需要的营养物质，如蛋白质、维生素等，因此酵母菌的添加也能为水产动物提供蛋白质营养，促进水产动物生长，这类酵母被称为饲料酵母[36]。深入研究益生菌的功能机理，益生菌提升水产动物营养吸收能力是通过几个不同的方面来发挥其生物学功能的。有学者发现益生菌是通过影响水产动物消化道中消化酶的活性来提高水产动物营养吸收能力的。例如，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strainsL10，G1）能够提高凡纳滨对虾消化道中蛋白酶和淀粉酶的活性，从而诱导增加其总蛋白含量[8]。此外，将乳酸菌属的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）作为益生菌添加至凡纳滨对虾的饲料中时，嗜酸乳杆菌可以对不同的消化器官产生不同程度的影响，并增加其不同消化器官中酶的活性，而且对肠道中蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性的提高效果最为显著[25]，这说明益生菌在进入水产动物消化道后能影响消化道内各种酶的活性，进而影响水产动物的食物转化效率和生长速率。除影响消化道内酶的活性以外，还发现益生菌在进入肠道后能够使水产动物肠道绒毛的长、宽度增加，并改善肠道的营养吸收机能[37]。例如，任雪等[38]将热灭活的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和复合益生菌（GH35A，GH35B）的组合作用于凡纳滨对虾，发现能够使凡纳滨对虾的肠壁增厚，并提升肠道绒毛整齐程度。将枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilisBS1 (MW447607)]、植物乳杆菌[Lactobacillus plantarumLP1 (MW447608)]以及粪肠球菌[Enterococcus faecalisEF1 (MW447606)]添加至饲料中饲喂鲈鱼8 周之后，鲈鱼的肠道绒毛长度和肠壁高度明显增加[39]。以上研究说明在饲料中添加益生菌能够影响水产动物肠道结构。此外，Reda 等[40]发现提高尼罗罗非鱼饲料中解淀粉芽孢杆菌孢子（Bacillus amyloliquefaciensspores）的含量能够显著增加尼罗罗非鱼肠道中肠道绒毛的高度。肠道绒毛、肠壁高度的增加会使肠道表面积增加，这能直接有效地提高其饲料转化率。解淀粉芽孢杆菌孢子（Bacillus amyloliquefaciens spores）会增加罗非鱼肠黏液中杯状细胞的数量，而罗非鱼对藻类极强的消化吸收能力很可能与肠道中杯状细胞分泌的酸性黏液有关，肠内杯状细胞的增加会提升其对浮游植物的消化吸收能力[40-41]。另外，部分益生菌在代谢过程中能产生胞外酶，这也会促进肠道内食物的消化。例如，乳酸菌能够分泌脂肪酶、蛋白酶等消化酶，可以分解肠道中大分子有机物，促进水产动物消化吸收能力[42]。相较于前两种机理，依赖于胞外酶的作用方式比较简单，筛选拥有该功能的水产益生菌时，只需要着重检测益生菌的代谢产物即可。部分益生菌对不同水产动物营养吸收能力的影响见表1。

表1 部分益生菌对不同水产动物营养吸收能力的影响

2.2 激活强化水产动物免疫系统

越来越多的研究发现，水产动物的饲料中添加益生菌能够激活和强化水产动物的免疫系统，提升水产动 物 的 免 疫 能 力[27，40，43，46-47]。在 中 药 和 芽 孢 杆 菌（TCMBS）混合制剂的作用下，尼罗罗非鱼出现了对无乳链球菌（Streptococcus lactis）感染的抗性，使其能够保持较低的死亡率；在添加枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1：1混合制剂，同样也出现了对无乳链球菌感染的抗性[43，48]。此外，Aly 等[20]发现短小芽孢杆菌（B.pumilus）能够改善尼罗罗非鱼的抗病能力，增强罗非鱼的免疫应答。在具体作用机理方面，有学者发现益生菌添加能提升水产动物体液免疫能力。例如，Abarike等[48]发现添加枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）混合菌剂后尼罗罗非鱼的血清和皮肤黏液中的免疫球蛋白浓度升高。同属芽孢杆菌的解淀粉芽孢杆菌的孢子（Bacillus amyloliquefaciens spores）则能够显著增加尼罗罗非鱼肠道内分泌肠黏液的杯状细胞数量，杯状细胞分泌液形成的保护层可以有效隔绝外来入侵细菌，在一定程度上增强了水产动物抵抗外来细菌入侵的能力[40，49]。Das 等[46]研究发现解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciensFPTB16）饲喂卡特拉鲃时，能够刺激卡特拉鲃全身免疫分子大量合成，其体内重要的免疫球蛋白等防御分子数量显著增加。芽孢杆菌制剂（Bacillus licheniformisandBacillus subtilis）饲喂草鱼后也能增加血清中免疫球蛋白的含量[50]。其他学者研究发现益生菌也能通过提高水产动物血清之中的溶菌酶含量来增强水产动物的免疫能力。例如，Zhang 等[39]发现1×108CFU/g 的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisBS1 MW447607)添加能显著提高鲈鱼血浆中的溶菌酶浓度，从而增强鲈鱼的免疫能力。同样的，芽孢杆菌制剂也能有效提高草鱼、罗非鱼等其他水产动物血清中的溶菌酶含量[48，50]，这表明芽孢杆菌这类益生菌能够通过增加水产动物血清中免疫球蛋白和血清溶菌酶的含量来增强其免疫能力。Tang等[51]发现，把枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisCh9）添加到草鱼饲料中，能够抵消嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）引起的血清、肝脏和肠道脂质氧化损伤，使得草鱼表现并维持高水平的抗氧化防御状态，抵御嗜水气单胞菌造成的细菌性败血症。Midhun 等[45]的研究中发现地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisHGA8B）能增加罗非鱼的抗氧化能力，能增强机体的修复和抵抗病原菌能力。除直接增加水产动物抵抗能力外，特殊处理的芽孢杆菌还能增强水产动物对特定疾病的抵抗能力。例如，表面表达华支睾吸虫副肌球蛋白的枯草芽孢杆菌孢子（Bacillus subtilis spores）制成的口服药能够保护草鱼，降低其鱼肉之中包蚴的数量，使其能够对抗华支睾吸虫[52]，这有效减小了华支睾吸虫对草鱼的伤害。

不仅是芽孢杆菌，其他益生菌也有类似情况。乳酸乳杆菌（Dairy yogurtLactobacillussp.）也能够提升罗非鱼的血清溶菌酶含量[35]。Chen 等[10]实验时发现，长期使用颗粒饲料导致的鳜鱼血清溶菌酶含量降低这个问题，可通过添加鼠李糖乳杆菌[Lactobacillus rhamnosus(ATCC 7469)]和植物乳杆菌[Lactobacillus plantarum(ATCC 8014)]等益生菌得到显著改善。以上研究表明，益生菌辅助水产养殖的技术，为高密度养殖造成的水产动物免疫能力下降等问题带来了有效的解决方案。部分益生菌对不同水产动物免疫系统的影响见表2。

表2 部分益生菌对不同水产动物免疫系统的影响

2.3 调节水产动物肠道菌群结构

水产动物的肠道菌群对水产动物的生长、发育、免疫等生理活动起着重要的调控作用。肠道菌群不仅能影响水产动物的生长，还能抵御外来致病菌的入侵，因此维持水产动物肠道菌群结构的合理和稳定，对水产动物养殖来说是十分重要的[53-55]。很多研究发现水产饲料中添加益生菌能够影响和改善水产动物的肠道菌群结构[38,56]。王磊等[37]将含枯草芽孢杆菌的复合益生菌饲喂给眼斑双锯鱼（Amphiprion ocellaris）后，其肠道内同属厚壁菌门的肠道菌群丰度有所提升。Zokaeifar等[8]发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strainsL10，G1）添加可以有效降低凡纳滨对虾被哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）感染的死亡率，深入研究后发现枯草芽孢杆菌会在其肠道中定植，通过竞争作用创造一个不易被其他病原体感染的环境。还有研究发现植物乳杆菌（LP HMX-3）可以调节仿刺参肠道菌群结构，利用竞争作用减少水产动物肠道中有害菌的数量[33]。大多数水产动物肠道中的有益细菌多数为厌氧细菌、少数为好氧细菌，而有害细菌则相反。枯草芽孢杆菌定植于水产动物肠道以后，其进行的有氧呼吸会降低肠道中氧气的含量，进而抑制了好氧菌的生长繁殖，从而在一定程度上抑制了病原菌对水产动物的伤害作用[57-58]。乳酸菌也能通过分泌一些抑制病原菌生长的物质如抗生素、过氧化氢等，维持水产动物肠道的健康[59]。张强[30]的研究发现，枯草芽孢杆菌Z2能够增加鲫鱼肠道中的优势菌群，平衡其肠道菌群结构；当枯草芽孢杆菌分别与光合细菌、乳酸菌组合的时候能够发挥更好的调节肠道菌群的功能。同种益生菌对不同水产动物的作用也不完全相同，如上述枯草芽孢杆菌可以减少鲫鱼肠道中好氧菌的数量，但将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisC-3102）饲喂给罗非鱼后，罗非鱼肠道内好氧菌的数量却有所增加[60]。部分益生菌对不同水产动物肠道菌落结构影响见表3。

表3 部分益生菌对不同水产动物肠道菌落结构的影响

2.4 影响水产动物部分基因的表达

益生菌会对水产动物某些基因的表达产生影响，其对不同基因表达的影响会产生不同的生物学效果见表4。Midhun 等[45]发现地衣芽孢杆菌 HGA8B（Bacillus licheniformisHGA8B）的添加显著提高了罗非鱼肝脏中四个参与生长的基因表达量。地衣芽孢杆菌不仅能影响水产动物生长有关基因的表达，还能调控免疫相关的基因。将地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）混合饲喂罗非鱼后，显著促进了抗SMAD3 相关基因的表达[48]。在Abarike 等[43]的实验中，所有添加中药与芽孢杆菌混合制剂的罗非鱼体内β-防御素、溶菌酶、CAT 等免疫相关基因的表达水平显著提高。还有学者研究发现植物乳杆菌（LP HMX-3）可以提高仿刺参几种免疫酶的活性和免疫相关基因的表达[33]。使用表面表达华支睾吸虫副肌球蛋白的枯草芽孢杆菌孢子（Bacillus subtilis spores）作用于草鱼时，草鱼的脾脏、肾等器官中促炎细胞因子的基因表达水平有所提高[52]，说明不单是益生菌，益生菌孢子也能影响水产动物与免疫相关基因的表达。另外，在Sun等[52]的实验中，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisHGA8B）促进了草鱼前肠中编码紧密连接蛋白和黏蛋白-2 基因的表达，有利于形成肠道屏障，增加胃肠道保护层的黏蛋白量[45]。因此，益生菌制剂在进入水产动物肠道以后，可以通过影响肠道屏障有关基因的表达来维持和修复肠道健康。

表4 部分益生菌对不同水产动物基因表达的影响

以上这些研究说明，益生菌制剂在水产动物养殖中的添加，会通过影响水产动物促生长、免疫、肠道健康等相关基因的表达，改善和维持水产动物的健康状态，提高水产养殖的效率。

3 小结与展望

当前全球水产养殖业已经开始向高产、可持续发展的方向发生转型。益生菌辅助水产养殖的技术在改善水产动物营养物质吸收能力、提高免疫能力、改善肠道菌群结构等方面具有显著功效，这在未来水产养殖业中有着广阔的应用前景。但任何技术都有其适用性的问题，我们应该在发挥该技术优势的同时，尽量避免带来消极的影响，同时促进技术的升级和改进。水产养殖中益生菌制剂的未来发展道路还很长远，还需要从以下几个方面进行深入探索。首先是益生菌的安全性问题，即便是使用最广泛、公认最安全的枯草芽孢杆菌，近期也被发现其部分菌种可能会产生有害物质[61]。益生菌制剂对环境是否会产生不良影响仍缺乏科学评估，现阶段益生菌安全评价系统依然不够完善，缺少对各种益生菌功能和利害方面的详细数据。其次是益生菌投放量和针对性的问题，益生菌一般作为饲料添加投放到水体之中，养殖水域的环境会影响饲料中益生菌的数量和效果，这就需要研究更加稳定和对各种不同水域环境有一定针对性的益生菌制剂。目前我国水产养殖压力日渐增大，寻找高效稳定且具针对性的益生菌制剂迫在眉睫[3]。再次，除普通益生菌以外，工程益生菌也有着较大的发展潜力。如表面表达华支睾吸虫副肌球蛋白的芽孢杆菌融合孢子就使得华支睾吸虫对草鱼的危害程度下降[52]。对工程益生菌有益作用机理的深入探索，未来可能将部分安全性高的工程益生菌投入动物研究，让水产动物获得抵抗部分病原菌的能力，这样能创造巨大的经济和社会价值。最后，复合益生菌制剂的研究，不仅是将不同的物质与益生菌结合起来，还有多种益生菌相互组合，能够使益生菌制剂发挥出更大的生物学作用。总之，益生菌制剂在绿色水产养殖业有着广阔的应用前景，相信未来技术不断发展，有关益生菌制剂的组合种类会越来越多，其生物学效果也会越来越好。