畜禽养殖废弃物中抗生素的微生物降解研究进展

谢晓杰,许双燕,王文凡,杨 健,赵卓群,王 敏,郑华宝

(浙江农林大学 环境与资源学院,浙江省土壤污染生物修复重点实验室,浙江 杭州 311300)

近年来,我国畜禽养殖业的规模化、集约化发展水平不断提高,但高密度的养殖模式也引发了一系列的畜禽疾病,用于预防、治疗畜禽疾病的抗生素类药物也被使用得更加频繁。然而,动物体摄入的抗生素并不能完全地被代谢吸收,超过70%的抗生素会随尿液和粪便排出体外[1],释放到环境中,并导致环境中抗生素的残留。长期的抗生素选择压力会诱导抗生素耐药菌的产生,引发严重的抗性基因污染问题[2-3],对公共健康造成巨大威胁。据报道,如果抗生素抗性基因的传播失控,预计在2050年将导致全球超过1 000万人死亡,造成近100万亿美元的全球财政负担[4-5]。为此,本文综述了畜禽养殖废弃物中抗生素的残留现状、危害,总结了抗生素降解菌的降解特征和抗生素的生物降解途径,讨论了抗生素降解菌在堆肥中的应用,以期为畜禽废弃物中抗生素污染的治理提供参考。

1 畜禽养殖废弃物中抗生素污染状况与危害

在畜禽养殖过程中,合理使用抗生素添加剂能够有效地治疗动物感染性疾病,促进畜禽生长[6-7]。我国是世界上最大的抗生素生产和消费国,据统计,2020年的抗生素产量达22.3万t[8-9],其中用于畜禽养殖业的抗生素达3.27万t[10]。抗生素在畜禽养殖中的大量使用,导致其在畜禽养殖废弃物中大量残留。

1.1 畜禽养殖废弃物

畜禽养殖废弃物是指在畜禽养殖过程中产生的畜禽粪便、废饲料、养殖废水、恶臭气体,以及散落的毛、羽等废弃物[11]。据估算,我国每年产生的畜禽养殖废弃物已达38亿t,但综合利用率不足60%[12],其中,畜禽粪便约占40%,总量约为15亿t[13]。

目前,我国畜禽养殖废弃物最主要的处理方向为肥料化[14]和能源化[15-16]。肥料化处理是利用堆肥、生物发酵技术将畜禽养殖废弃物转化为有机肥料;能源化处理是以畜禽养殖废弃物为原料制备沼气、沼液和沼渣,从而实现废弃物的再利用[17-18]。然而,我国多数畜禽养殖企业不具备粪污的深加工处理能力,一些地方将堆积发酵后的粪便直接施于农田,导致畜禽养殖废弃物中残留的抗生素进入环境,造成抗生素污染[19]。

1.2 畜禽养殖废弃物中抗生素的污染状况

现代集约化畜禽养殖常用抗生素来控制疾病,促进畜禽生长[20]。据统计,2017年全球兽用抗生素消费总量约为93 309 t,预计到2030年全球兽用抗生素消费总量将达到104 079 t,较2017年增长11.5%[21]。大多数发达国家兽用抗生素的使用量占抗生素生产总量的50%～80%[22]。据一项发表于2015年的报道,美国兽用抗生素使用总量达11 148 t,占抗生素销售总量的80%[23-24]。我国是世界上最大的兽用抗生素消费国,2020年兽用抗生素使用量高达32 776 t[10],预计到2030年我国的兽用抗生素消费量将占全球兽用抗生素消费总量的43%[21]。

由于多数养殖户缺乏专业的疫病防治知识,抗生素不规范、不合理、超量使用等现象在我国畜禽养殖中较为普遍[25]。有调查表明,2020年我国每生产1 t动物产品的兽用抗生素使用量约为165 g[10]。动物摄入的抗生素不能被机体完全吸收,30%～90%会以原形或代谢产物的形式残留在畜禽粪便中[26-28]。受畜禽养殖业中各种畜禽(主要指猪、牛、鸡等)生理特性、生活习惯和养殖环境等差异的影响,不同畜禽粪便中的抗生素种类、含量存在显著差异[29],但总体而言,畜禽粪便中不同类型抗生素的残留量从高到低依次为四环素类>氟喹诺酮类>磺胺类>大环内酯类[30-32]。Wang等[33]调查了浙江省不同养殖场猪粪中的抗生素残留,发现金霉素残留量最高,达到57.95 mg·kg-1。任君焘等[34]对山东东营地区畜禽粪便中的抗生素残留进行研究,发现畜禽粪便中磺胺类抗生素的检出率为6%～100%,氟喹诺酮类抗生素的检出率为62%～100%,四环素类抗生素的检出率为98%～100%,大环内酯类抗生素的检出率为0%～50%。彭秋等[35]对重庆地区的畜禽粪便进行调查,发现猪粪中四环素类抗生素的检出率为82.8%,土霉素、四环素和金霉素的最大检出量分别为11.59、53.14、23.06 mg·kg-1。Alavi等[36]对伊朗5个城市养殖场的粪便进行调查,发现四环素和土霉素的最大检出量分别为5.36、13.77 mg·kg-1。Ezzariai等[37]对粪便中的四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类抗生素进行检测,发现四类抗生素的残留量为1～136 000 μg·kg-1。

畜禽粪便中残留的抗生素会通过自然渗透、雨水淋溶、径流冲刷,以及有机肥施用等方式进入水体与土壤中,导致畜禽养殖场周围环境中的抗生素含量超标[38]。有研究表明,养猪场附近的地表水、地下水和土壤中均发现四环素类和磺胺类抗生素残留,且最大检出量可达10-9级别[39]。陈军平等[40]调查了江西南昌地区12个规模化养猪场下游水体中的抗生素残留情况,发现四环素、金霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲恶唑、诺氟沙星、氧氟沙星的检出率分别为58.3%、33.3%、66.7%、75.0%、41.7%、100.0%。畜禽粪便有机肥中抗生素的残留和迁移也会导致土壤污染。Qian等[41]调查了浙江省粪肥中的抗生素含量,发现恩诺沙星检出率为39.3%,含量为6.7～4 091 ng·L-1。Li等[42]对山东寿光地区施用畜禽粪便有机肥的集约化蔬菜种植区土壤中的氟喹诺酮类抗生素进行调查,发现土壤中环丙沙星和诺氟沙星的最大检出量分别为0.652、0.288 mg·kg-1。

1.3 畜禽养殖废弃物中抗生素残留的危害

部分抗生素性质稳定,在环境中难以自然降解,当其累积到一定量后会严重影响土壤与水体中微生物的活性和群落结构,对生态环境产生负面作用,并最终影响整个生物圈的物质循环[43-45]。残留在土壤中的抗生素还会导致土壤结构和生态功能发生改变,并影响土壤微生物群落结构和土壤酶活性[46-48]。周椿富等[49]研究发现,抗生素残留会抑制土壤中的脲酶活性,减慢土壤物质循环,降低土壤生态系统的功能稳定性。方林发等[50]在重庆开州区菜地土壤的研究发现,四环素类和喹诺酮类抗生素对土壤动物和微生物存在潜在毒性。水体与沉积物中残留的抗生素会干扰水环境中微生物的正常功能,影响氮、磷循环[51-53]。Devries等[54]研究表明,沉积物中的硝化菌和反硝化菌对质量浓度低至1 ng·L-1的抗生素仍较为敏感。龙婷婷[55]研究了四环素对生物脱氮除磷效果的影响,发现若活性污泥系统长期暴露于5、10 mg·L-1的四环素中,其硝化作用和反硝化作用均会受到影响,总氮去除率从85.4%分别降至78.6%和75.6%,系统的除磷能力也受到一定的抑制。

环境中残留的抗生素被动植物吸收后,还会通过食物链富集,最终流向人类。有研究表明,土壤中残留的抗生素及其代谢产物会沿木质部向茎、叶迁移,继而贮存于植物体的各有机组分中[56-57]。李彦文等[58]调查了广州市长期施用有机肥的蔬菜样品,发现96%的市售蔬菜样品中均可检测到不同程度的喹诺酮类抗生素残留,残留量在1.0～1 683.1 μg·kg-1。抗生素在动物体的蓄积也会导致动物副产品,如肉、蛋、乳、内脏等,存在抗生素残留[59]。贝亦江等[60]对2018—2019年浙江省养殖水产品中的6种喹诺酮类抗生素进行调研,发现6种喹诺酮类抗生素的检出率为0～24.2%,残留量为0～964 μg·kg-1。人类若长期食用受抗生素污染的食物,可能会导致抗生素在体内蓄积,当其达到一定浓度后,会导致人体中毒和各器官病变,产生过敏反应、肾病、肝损伤、骨髓毒性和致癌等副作用,严重危害人类健康[61]。

畜禽废弃物中残留的抗生素排泄到环境后,会对微生物产生选择压力。大量研究表明,抗生素长期选择压力会促进耐药细菌的产生,导致抗生素抗性基因的传播[62-63]。抗生素抗性基因广泛分布于土壤、水体、空气和畜禽粪便中,可通过多种方式直接或间接地在环境介质中传播扩散,并进入人体微生物组,导致人体产生抗生素耐药性[64-65]。有研究表明,在环境中非亲子之间的耐药性菌株可以通过结合、转化和传导等多种方式进行抗性基因的水平转移[66-67],亲子之间的耐药性菌株可通过自我繁殖的方式将抗性基因垂直转移给子代,从而导致抗性基因的扩散[38]。冯天舒等[68]在高原鼠兔和高原鼢鼠肠道微生物中检出3种四环素类抗性基因(tetQ、tetM-01、tetG-01)、2种磺胺类抗性基因(sul1、sul2)和1种多重耐药性基因(floR),这些抗生素抗性基因会转移至人体,并对人类健康构成严重威胁。

2 抗生素的微生物降解

2.1 抗生素的环境行为

抗生素进入水、土壤等环境介质后继而发生吸附/解吸[69]、迁移[70]、降解[71]等行为,直接或间接地影响抗生素在环境中的生态毒理效应[72]。吸附/解吸是一种典型的抗生素环境行为[73],亲和力较强的抗生素在进入环境后会被稳定吸附在土壤颗粒表面,并长期发挥作用。但与沉积物结合的抗生素也会发生解吸反应,将抗生素再次释放到环境中[74]。同时,部分抗生素在进入环境后会通过地表径流和雨水淋溶向下迁移,进入更深的土壤层或地下水系统中[70],导致土壤、地表水、地下水和沉积物中出现多种抗生素的残留[75-76]。一般而言,抗生素的吸附/解吸和迁移行为与抗生素本身的理化性质和环境因子密切相关[77]。

在自然条件下,环境中的抗生素会通过物理、化学和生物方式被降解[78]。抗生素的自然降解过程中会产生多种转化产物[79],但一些产物可能具有与母体相当甚至更强的毒性,如Xu等[80]研究发现,磺胺吡啶的光化学降解产物就比母体化合物的毒性更大。

光解、水解和生物降解是抗生素自然衰减的主要途径。在畜禽养殖废弃物残留抗生素的处理方法中,通过微生物降解将抗生素分解成毒性较低或无毒害作用的小分子产物,是目前最为经济有效的方法之一,此方法条件简单,易控制,成本较低[81]。因此,有必要对抗生素的微生物降解进行深入研究。

2.2 抗生素降解菌的降解特征

近年来,学者通过筛选、驯化等方式获得了许多抗生素降解菌,这些降解菌多为细菌,实验室降解条件多为温度30～40 ℃,pH值5.8～9.0,抗生素质量浓度20～300 mg·L-1。一些降解菌能够以抗生素作为唯一碳源或氮源[82-101],如甲基菌属(Methylobacillussp.)、新型黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)HS51株和假单胞菌属(Pseudomonassp.)T4株等。但也有一些降解菌不能直接利用抗生素,需外加碳、氮源(如酵母、葡萄糖或蛋白胨等)才能有效降解抗生素[102-117],如斯氏普罗威登斯菌(Providenciastuartii)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)等,外加碳、氮源可通过增加微生物的生物量进而提高其对抗生素的降解[118]。将当前报道的部分抗生素降解微生物及其降解性质整理于表1。

表1 降解抗生素的微生物及其降解条件Table 1 Antibiotics-degrading microbes and degradation conditions

值得注意的是,目前针对抗生素污染的风险评估和降解菌筛选多是在单一抗生素条件下开展的,在实验室设定的最佳条件下,降解菌能够在较短时间内降解高浓度的抗生素,但实际环境中的抗生素残留量远低于实验室水平[76-77]。同时,野外水体、土壤中并不具备丰富的营养基质,以及适宜的温度和pH值等条件,多种抗生素常以复合共存的形式出现,其危害远大于单一抗生素[119]。González-Pleiter等[120]发现,当两种抗生素以混合物形式存在时,即使在非常低的浓度下,也会对藻类表现出毒害作用。Backhaus等[121]研究发现,混合抗生素的生态风险远高于单一抗生素。因此,未来应加大对环境浓度下抗生素的降解研究,同时进一步筛选能够同时降解多种抗生素的菌株。

2.3 抗生素的微生物降解途径与机理

微生物降解抗生素的过程较为复杂。在特定环境下,微生物产生的酶可通过直接或间接修饰改变抗生素的结构使其失活,并逐步将其分解成小分子化合物[122-123]。微生物降解抗生素的途径主要包括羟基化/去羟基化、官能团氧化、碳链断裂、水解和基团转移等[81,124]。不同种类的抗生素结构不同,其生物降解途径也存在明显差异[122]。

对抗生素生物降解途径的研究有助于抗生素污染生物防治的开展。四环素类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类抗生素是畜禽养殖废弃物中最常检测到的抗生素[10],以下围绕这4种抗生素的生物降解途径进行综述。

磺胺类抗生素中苯环上的对氨基苯磺酰胺基是使其具有抗菌活性的主要结构。若磺胺类抗生素中的苯环被其他芳环或芳杂环取代,或在苯环上引入其他基团,均会降低磺胺类抗生素的抑菌效果[128-129]。研究表明,微生物可通过水解、脱硫(—SO2)、脱氨基(—NH2)、氧化等反应降解磺胺类抗生素[91,118,130]。Du等[91]研究发现,水生产碱杆菌(AlcaligenesaquatillisFA)通过脱硫、脱氨基等途径降解磺胺对甲氧嘧啶。Jiang等[130]研究发现,磺胺甲恶唑可在微生物的作用下通过水解、脱硫、脱氨基等反应生成不同的中间产物,包括苯胺、3-氨基-5-甲基异恶唑、4-氨基苯硫酚和磺胺等。

微生物通过水解、断裂酯键、脱糖等反应破坏大环内酯类抗生素的分子结构,从而降低其抗菌活性[102-103]。Zhang等[103]在研究产酸克雷伯氏菌(KlebsiellaoxytocaTYL-T1)对泰乐菌素的降解时发现,在降解菌的作用下,泰乐菌素经过糖基转移、氧化还原、酯键断裂等途径发生降解。

喹诺酮类抗生素在降解菌的作用下经取代、羟基化、去氨基化等反应转化成小分子物质[131-133]。Liao等[133]研究发现,在微生物的作用下,环丙沙星可通过丢失哌嗪基团、苯环上的环丙基和氟原子,以及去氨基和去羟基化反应实现降解。

总的来说,不同抗生素在微生物作用下的降解位点和方式大抵相同,但不同微生物降解抗生素时发生反应的顺序不同,所产生的中间产物也有所不同;因此,对不同菌株降解抗生素的中间产物进行研究依然很有必要。

3 微生物降解去除畜禽养殖废弃物中抗生素的应用进展

消减畜禽养殖废弃物中的抗生素是降低水体和土壤中抗生素污染的重要对策之一[134]。在处理畜禽养殖废弃物的各种方法中,堆肥因具有成本低、有机物降解快、无害化程度高的特点,而成为我国畜禽养殖废弃物资源化利用中最主要和最常用的措施之一[135]。在堆肥过程中,微生物可通过各种生化反应将畜禽粪便中的有机质分解并转化为腐殖质。根据堆肥中氧气的供应情况,可将堆肥分为好氧堆肥和厌氧发酵两类[136]。

好氧堆肥和厌氧发酵过程中,抗生素的去除效果与堆体温度、含水量、抗生素种类和浓度、微生物等密切相关[137]。温度会影响堆体的理化性质和微生物的代谢活动,进而影响畜禽粪污中抗生素的消减效果[138-139]。Feng等[140]研究了高温(52 ℃)和低温(15 ℃)条件下猪粪厌氧堆肥中红霉素的去除情况,发现温度升高可有效缩短红霉素的半衰期。水分会调节堆体温度,影响微生物代谢和抗生素水解,一般来说,堆肥原料中的含水量应控制在50%～70%,含水量过低不利于微生物的生长代谢,但过高则会堵塞堆料的缝隙,进而影响抗生素的消减[141]。不同类型的抗生素,其分子结构不同,理化性质也有所差异;因此,堆肥过程中不同抗生素的去除效果也有所差别。Kim等[142]研究了猪粪堆肥中不同抗生素的消减情况,发现40 d堆肥结束后,金霉素、磺胺甲嘧啶、泰乐菌素的去除率各不相同。抗生素的初始质量分数不同,堆肥后其消减效果也明显不同。孟磊等[143]开展的鸡粪堆肥研究发现,不同初始质量分数的喹诺酮类抗生素降解速率从高到低依次为60 mg·kg-1>30 mg·kg-1>15 mg·kg-1。

堆肥是由微生物主导的发酵过程[134],温度、含水量、抗生素的种类和含量均会直接或间接地影响堆体中微生物的生长代谢活动,进而影响堆肥中抗生素的降解和转化[144]。在好氧堆肥过程中,微生物可通过各种代谢活动分解有机物、释放能量,进而保障微生物正常的生长繁殖[145]。在厌氧发酵过程中,微生物会产生各种水解酶,并通过各种水解酸化作用将大分子有机物分解成小分子有机物,进而提高厌氧发酵的效率[146]。大量研究表明,在堆肥过程中添加外源抗生素降解菌剂可加速畜禽养殖废弃物中抗生素的去除,并显著提升堆肥的质量[147]。李玮琳等[148]将抗生素降解菌剂接种到猪粪堆肥中,发现抗生素去除率达81.95%,与对照组相比,抗生素降解率提高了42.18%。赵晨光等[149]将筛选的4株抗生素降解菌接种到猪粪堆肥中,14 d后,土霉素、四环素、金霉素的降解率分别为85.75%、90.95%、98.56%。张锦[150]将抗生素混合降解菌剂加入猪粪、鸡粪堆肥中,发现猪粪、鸡粪中磺胺二甲嘧啶的去除率分别为77.48%、45.39%。仇天雷等[151]研究发现,添加复合菌剂后,堆肥中的土霉素在47 d后降解至检测限以下,而未接种菌剂的对照组,其土霉素降解效果不明显。

外源接种抗生素降解菌剂会提高堆肥中抗生素的去除效果,具有较好的发展前景;但是,在堆肥中能够降解抗生素的微生物一般都是耐药菌,这些菌株携带大量的抗性基因,因此应格外注意堆肥过程中添加外源抗生素降解菌可能诱发的抗性基因污染风险[152-154]。目前,关于外源添加的抗生素降解菌中抗生素抗性基因的研究较少,考虑到堆肥中应用抗生素降解菌存在抗性基因传播风险,未来可将降解菌内发挥作用的酶提取出来并应用到堆肥中,以提高抗生素降解效果,降低抗性基因污染风险。

4 研究展望

畜禽养殖废弃物作为抗生素的“天然储存库”,如不能得到及时妥善的处置,将会导致土壤、水体中的抗生素含量超标,给生态环境带来负面作用。同时,残留的抗生素被动植物吸收后,还会通过食物链富集,严重威胁人体健康。抗生素降解菌是天然存在的“降解剂”,具有效率高、适应面广的优点。将微生物与堆肥相结合,是实现畜禽养殖废弃物无害化处理的有效措施,颇具发展前景。为了更好地解决畜禽养殖废弃物中抗生素残留污染的问题,未来研究可从以下几个方面进行:(1)加强对环境条件下抗生素降解菌的筛选研究,驯化、筛选能够同时降解多种抗生素的菌株,或对已筛选到的单一抗生素降解菌进行复配,以便更好地降解复杂环境中残留的多种抗生素;(2)加强对微生物降解抗生素机理、途径、产物毒性的研究,进而促进畜禽养殖废弃物中残留抗生素的去除;(3)可将抗生素降解酶制成酶制剂,并应用于堆肥中,进而有效治理抗生素污染,防止抗性基因进一步传播。