白花悬钩子的叶片组培快繁与植株再生研究

覃春梅 李斌 傅鹏 盘涌 谭小明 姚绍嫦

摘要：为获得一套完整高教的白花悬钩子（Rubus leucanthus Hance）组培快繁技术体系，以叶片为外植体，系统研究了外植体不同灭菌时间、不同植物激素配比及浓度对愈伤组织诱导及丛生芽分化、增殖和生根的影响，并进行了组培苗移栽。结果表明：最佳的外植体灭菌方式为2% NaCIO溶液2 min+0.1% HgCI2溶液5min，实现了污染率最低（23.33%）、存活率最高（73.33%）；最佳的丛生芽分化诱导培养基为MS+3.0 mg．L-16-BA+0.5 mg.L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA，愈伤组织诱导率为100%，芽诱导率为93.33%；6-BA与KT对增殖系数有显著影响，最佳的继代增殖培养基为MS+2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA，培養20 d的增殖系数达7.84；最适的生根培养基为1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA，生根率为100%，移栽成活率为86.67%，实现平均株高3.02 cm、平均根长6.16 cm、平均根数8.67条与平均叶数2.47片。本研究结果既可为白花悬钩子优质种苗的工厂化生产提供技术支持，又可为悬钩子属植物叶片组培快繁体系的建立提供参考依据。

关键词：白花悬钩子；叶片；组培快繁；植物激素；移栽

中图分类号：S567.1+9：Q949.751.8 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0071-07

白花悬钩子（Rubus leucanthus Hance）是蔷薇科悬钩子属的落叶灌木，又名白钩筋藤、南蛇筋，以根或果实入药，分布于湖南、福建、广东、广西、贵州、云南等地，常见于低海拔至中海拔的疏林或旷野中。白花悬钩子是一种传统的壮瑶药材，被广泛收载于《药用植物辞典》《中国中药资源志要》《广西中药资源名录》等中医药学文献资料中。据《岭南中草药迁地保护图谱》记载，白花悬钩子味苦，性凉，具有利湿、解毒的功效，民间常用于治疗腹泻、赤痢口]。类似于同属植物掌叶覆盆子（Rubus chingii Hu），白花悬钩子的果实成熟时呈红色，味道酸甜可口，也是一种重要的功能性食品，营养丰富，可食用或药用，常用于治疗遗尿、肾虚、阳痿早泄、尿频、遗精等疾病。虽然白花悬钩子的化学成分尚未有相关的研究报道，但是悬钩子属植物的化学成分分析已有报道，可分为酚酸类、黄酮、三萜、挥发油、甾体和生物碱、多糖等类型。白花悬钩子药材目前仍以野生资源为主，随着近年来生长环境恶化及人为采挖加剧，野生资源已日益枯竭，根本无法满足医药市场的需求，开展人工种植前景广阔、势在必行。

在自然状态下，白花悬钩子主要依靠种子繁殖．但由于种子小、成熟果实常被鸟啄食、资源分布零散等因素，难以采收其种子进行人工繁殖。利用组织培养技术进行白花悬钩子的种苗繁育，具有繁殖速度快、繁殖系数高、后代遗传稳定性高等优点，可在短时间内获得大量优质种苗，对白花悬钩子种质资源保存与产业化生产具有重要意义。然而，目前尚未发现白花悬钩子组培再生体系的相关研究报道。有关掌叶覆盆子、树莓（Rubus idaeusL.）等同属植物的组培快繁研究报道可为白花悬钩子组培快繁体系的建立提供一定的参考依据。谢从寿等以掌叶覆盆子当年生茎段为外植体成功建立了组培快繁体系，分别在诱导培养基MS+1.5mg.L-1 6-BA+0.15 mg.L-1 NAA与增殖培养基MS+1.5 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 NAA上实现了较高的诱导率（68％）与增殖系数（4.87）；最佳生根培养基为1/2MS+0.6 mg·L-1 NAA+0.2 mg·L-IBA +0.8 mg·L-1活性炭，生根率达到95.3%，生根数达到5.7条，根长达到5.8 cm，根系发达，幼苗生长健壮。王利平等利用同样的材料也成功建立了掌叶覆盆子的组培再生体系，获得了更高的萌发率（>80％）与增殖系数（15.1），但使用了更低浓度的植物激素组合。徐亚英等以新生腋芽为外植体，着重探讨了不同浓度的6-BA、NAA、IBA在树莓离体快繁中的作用。

在悬钩子属植物的组培实验中，通常选取的外植体材料是一年生带芽嫩茎（单芽茎段）、茎尖或未萌发的腋芽，目前尚未发现使用叶片作为外植体材料来建立其组培快繁体系的研究报道。因此，本研究以白花悬钩子叶片为外植体，筛选出外植体灭菌的最佳方法及愈伤组织诱导、丛生芽分化和增殖、生根的最佳培养基配方，建立了其离体快繁体系，以期为白花悬钩子优质种苗的工厂化生产和悬钩子属植物叶片组培快繁体系的建立提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为白花悬钩子（Rubus leucanthus Hance），取自广西中医药大学科研种植基地，于晴天上午选择生长健壮、无病虫害的白花悬钩子植株，剪取嫩叶带回实验室。

1.2试验方法

1.2.1外植体灭菌处理 将白花悬钩子的嫩叶放入烧杯中，经0.05％的洗洁精水浸泡15 min后，流水冲洗30 min，然后在超净工作台上用不同的外植体灭菌方法（表1）进行灭菌；用无菌水浸洗灭菌后的嫩叶3-5次，再用无菌滤纸吸干表面水分，用灭菌解剖刀将嫩叶切成1 cm2左右的小块接种到初代诱导培养基上诱导愈伤组织与丛生芽。每个处理接种30瓶，每瓶接种1块叶片，3次重复，共90瓶。培养10 d，观察记录外植体的污染情况。

1.2.2初代诱导培养 以MS为基本培养基，添加不同质量浓度的6-BA、KT与NAA组合，并附加3.0％的蔗糖和0.5%的琼脂，调pH 6.0，配制成不同的初代诱导培养基（表2）。将叶片接种到不同的培养基上，每处理接种10瓶，每瓶接种3块叶片，重复3次，然后在（26±2）℃、光照强度2 000 lx、光照时间10 h/d的条件下培养30 d，观察记录愈伤组织诱导与丛生芽分化情况，以筛选出最佳的初代诱导培养基。

1.2.3继代增殖培养 待初代培养的丛生芽长至1.5-2.0 cm时，选择生长一致的单芽转接至以MS添加不同激素浓度的继代增殖培养基上，培养基附加3.0％蔗糖和0.5％琼脂（pH 6.0），6-BA、KT、NAA添加浓度采用Lg（34）正交试验设计方法进行筛选，因素与水平见表3。每个处理接种10瓶，每瓶接种3个芽，重复3次。在与初代诱导培养相同条件下培养20 d，观察记录增殖系数及再生芽的生长情况，以筛选出最佳的继代增殖培养基。

1.2.4生根培养 当继代增殖无菌苗长至1.5cm以上，从基部切下单个芽，接种至以1/2MS添加不同生长素的生根培养基中（表4），培养基附加3.0%蔗糖和0.5%琼脂，pH 6.0。每个处理接种10瓶，每瓶接种3個芽，重复3次。在（26±2）℃、光照强度1 000 lx、光照时间8 h/d条件下培养20 d，观察记录每个处理的生根情况，统计生根率、平均株高、平均根长、平均根数与平均叶数，以筛选出最佳的生根培养基。

1.2.5组培苗移栽 选取生长健壮、根系良好的组培苗，在自然光下驯化炼苗7d，然后打开瓶盖继续炼苗3～5 d，用镊子将组培苗轻轻从培养瓶中取出，用流水冲洗干净根部残留的培养基，移栽到装有混合基质的育苗杯中，混合基质为泥炭土+珍珠岩（体积比为3：1）；用塑料薄膜覆盖7d，之后揭开薄膜，在室内自然条件下继续培养。移栽后20 d，观察统计组培苗的移栽成活率。

1.3数据处理与统计分析

污染率（%）=（污染的外植体数／接种的外植体数）×100：

存活率（%）=（诱导出愈伤组织或丛生芽的外植体数／接种的外植体数）×100：

增殖系数=高度大于1.0 cm的有效芽数／接种芽数；

生根率（%）=（生根的芽数／接种的芽数）×100；

平均根数=总生根条数／生根的组培苗数；

移栽成活率（%）=（成活的组培苗数／移栽的组培苗数）×100。

试验数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS24.0软件进行处理分析，结果以平均值±标准差的方式表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVE）、Duncan's新复极差法进行多重比较。以P<0.05为差异具有统计学意义，表中的小、大写英文字母分别表示在0.05、0.01水平上差异显著、极显著。

2结果与分析

2.1不同灭菌方法对外植体灭菌效果的影响

由表5可知，不同灭菌方法的外植体污染率与存活率存在显著差异。单独使用0.1% HgCI2或2qo NaCIO进行处理时，外植体的污染率均高于50％，存活率均低于50％，与两者的组合处理相比存在极显著差异。当使用0.1％HgCl2与2％NaCLO进行组合处理时，污染率均低于30%，存活率均高于50%。当灭菌处理为2％ NaClO溶液2min+0.1％ HgCl2，溶液5 min时，外植体的污染率较低（23.33%），存活率最高（73.33%）且极显著高于其它处理。可见，当外植体在2% NaCLO溶液中灭菌2 min后继续在0.1% HgCl2溶液中处理较短时间，可获得较高的存活率，说明HgCl2可有效抑制外植体的污染，但灭菌时间过长容易对外植体造成毒害作用。综合污染率与存活率，我们认为白花悬钩子叶片最佳的灭菌方法为2% NaCIO溶液2 min+0.1% HgCl2溶液5min。

2.2不同植物激素种类与浓度对初代诱导培养的影响

由表6可知，不同激素种类与浓度配比的培养基均能使叶片诱导出愈伤组织，但丛生芽诱导率存在极显著差异。当6-BA浓度为2.0 mg·L-1、NAA浓度为0.2 mg·L-1时，随着KT浓度的逐渐升高，芽诱导率逐渐增加，变化范围为36.67％-60.00％；当6-BA浓度为3.0 mg.L-1、NAA浓度为0.5 mg.L-1时，配合较低浓度的KT（0.5 mg·L-1），获得了较好的丛生芽诱导效果，芽诱导率最高，达到93.33%，极显著高于其它处理。因此，我们认为白花悬钩子最佳的初代诱导培养基为MS+3.0mg.L-1 6-BA+0.5 mg.L-1 KT+0.5 mg.L-1 NAA。

2.3不同植物激素种类与浓度配比对继代增殖培养的影响

由表7可知，不同植物激素种类与浓度配比的培养基对白花悬钩子丛生芽的继代增殖存在极显著影响。当6-BA用量较低（1.5 mg·L-1）时，丛生芽的增殖系数随着KT与NAA浓度增加而极显著下降，此时丛生芽的生长情况不理想：若KT浓度过低，丛生芽的基部容易褐化，叶片容易变黄；若NAA的浓度过高，丛生芽容易长不定根。增加6-BA用量有利于获得较强的丛生芽生长势，6-BA、KT和NAA三种激素组合使用可获得较好的丛生芽增殖效果与生长状况，在2.5 mg·1-1 6-BA+1.5mg.L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA处理下丛生芽的增殖系数较高，生长势强且叶片保绿较好。

从正交试验的结果来看，在添加2.5 mg·L-16-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA的培养基中，白花悬钩子丛生芽的增殖系数最高，达到了7.84，极显著高于其它处理。根据极差分析结果K值大小，我们初步确定最优组合为A383C2，即2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1NAA。从方差分析结果（表8）可见，6-BA（ P<0.01）和KT（P<0.04）均对增殖倍数有显著影响，而NAA对结果无显著影响（P>0.87），表明在白花悬钩子丛生芽继代增殖过程中6-BA为主要因素，KT为次要因素。综合方差分析、极差分析和增殖系数，确定白花悬钩子继代增殖的最佳培养基为 MS+2.5 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4mg.L-1 NAA。

2.4不同质量浓度IBA与NAA对生根与移栽的影响

由表9可知，在1/2MS培养基中单独或者配合使用IBA与NAA均能使白花悬钩子的组培苗生根。当单独使用1.0 mg.L-1 IBA时，组培苗的平均株高、平均根长、平均根数与平均叶数均最高，分别达到了3.02 cm、6.16 cm、8.67条与2.47片，极显著高于其它处理；当单独使用1.0 mg·L-1NAA进行生根培养时，组培苗的平均根长、平均株高与平均叶数均处于较低水平，说明较高浓度的NAA会抑制组培苗的根与芽生长。当配合使用IBA与NAA时，组培苗的平均根长、平均株高与平均叶数等指标均显著低于单独使用1.0mg·L-1IBA（处理2）。因此，我们认为白花悬钩子的最佳生根培养基是1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA。

将白花悬钩子生根的组培苗经过驯化炼苗后移栽到泥炭土+珍珠岩（3：1，体积比）的混合基质中，20 d后植株生长良好，在生根培养基1/2MS+1.0 mg.L-1 IBA中培养获得的生根无菌苗移栽成活率最高，达到了86.67%，极显著高于其它处理。

综合上述分析，我们建立了白花悬钩子的叶片组培快繁体系，获得了生长良好的生根苗（图1）。

3讨论与结论

外植体灭菌是组织培养中的一个重要环节，自然环境中采集的外植体往往携带大量的微生物，因此要求在灭菌过程中既能有效杀灭微生物，又不能损伤植物组织，以保证植物体活性。HgCI2、INaCIO、C2HSOH与KMnO4等溶液常被单独或者组合用于外植体的灭菌，其组合方式与使用时间常会因材料而有所不同，需要经过试验才能确定最佳的灭菌方法。在同属植物树莓组织培养中，于丹考察了单独使用5% NaCl0与0.1% HgCl2的灭菌效果，认为用0.1％ HgCl2處理3min的效果最好：李艳霞等发现树莓“波拉纳”品种的茎段在75％酒精30 s+0.1％升汞8min+2%次氯酸钠2 min中灭菌可获得最低的污染率与最高的成活率。魏海霞等认为在对中国柽柳（Tamanx chinensis Lour.）进行外植体灭菌时采取75％酒精浸泡30 s、2％次氯酸钠浸泡3-5 min和升汞浸泡5 min最适宜。在本研究中，我们考察了单独使用与组合使用2％ NaClO与0.1％HgCl2溶液对白花悬钩子叶片灭菌的影响，发现当两者组合使用时可达到较好的灭菌效果，污染率均小于30%。由于灭菌剂的穿透力强，应严格掌握好处理时间，时间太长会破坏外植体的组织结构从而引起褐变，降低外植体的成活率。本研究采用2% NaCIO溶液灭菌2 min之后再使用0.1% HgCI2溶液灭菌5 min，能达到既有效杀死白花悬钩子叶片上的微生物又最小限度伤害外植体的目的，污染率仅23.33%，存活率达73.33％且极显著高于其它处理。

外植体的污染和褐化严重影响组培快繁技术成功水平，选择适宜的外植体，不仅可以大大降低其污染率与褐化率，还可进一步提高其成活率。在已有的悬钩子属植物组培试验中，通常选取的外植体材料是一年生带芽嫩茎（单芽茎段）、茎尖或以未萌发的腋芽作为材料，目前尚未发现用该属植物叶片进行组培快繁的研究报道。我们以白花悬钩子叶片为外植体，建立了其组培快繁技术体系，研究结果既可为白花悬钩子优质种苗的工厂化生产提供技术支持，又可为悬钩子属植物叶片组培快繁体系的建立提供参考依据。

对于悬钩子属植物，已有研究表明常见的MS、MT、White、N6、B5、NT等培养基均能满足其生长需要，但国内外的研究者们更多地选择MS培养基。Poothong等研究发现合理增加MS培养基中CaCl2、MgSO4和KH2PO4等无机盐的含量能显著促进悬钩子属植物的生长。本研究也选择MS作为基本培养基，探讨了不同植物激素种类及浓度对愈伤组织诱导、丛生芽分化和增殖以及生根培养的影响。

杨鼎元等对悬钩子属植物的组培快繁技术研究进展进行了综述，发现植物生长调节剂的种类与剂量会因物种、外植体类型与组培过程的不同阶段而各不相同。比如，红树莓（Rubus idaeus）的启动培养与增殖培养均需要较高浓度的GA3（2-8 mg·L-1）以促进丛生芽的诱导与增殖，而掌叶覆盆子仅需要添加6-BA单一细胞分裂素即可达到较好的丛生芽诱导与增殖效果。徐亚英等以新生腋芽为外植体，着重探讨了不同浓度的6-BA、NAA与IBA在树莓离体快繁中的作用。在本研究中，我们发现当3.0mg.L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1 NAA组合使用时，白花悬钩子的芽诱导率最高，达到了93.33％，极显著高于其它处理：对于丛生芽的增殖培养，3.0 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 KT+ 0.4mg·L-1 NAA组合使用也能在培养20 d后获得最高的增殖系数（7.84），这一结果与刘润和王鹏等分别在红叶石楠与路易斯安娜鸢尾‘Noble Moment上的研究结果一致。因此，我们认为6-BA与KT配合能有效提高白花悬钩子丛生芽的诱导率与增殖系数，效果优于单独使用的。前人在悬钩子属植物的生根培养中均使用1/2MS培养基，使用最多的生长调节剂是NAA和IBA这两种生长素，其剂量范围较低，通常为0.05-1.0 mg/L NAA、0.05-1.0mg/L IBA。我们通过对白花悬钩子组培苗的生根研究发现，白花悬钩子的组培苗较容易生根，在营养成分减半的MS培养基中添加利于根系生长的IBA或者NAA均能促进其生根，这一结果也验证了杨鼎元等的研究结论。

综合本研究结果，白花悬钩子最佳的叶片外植体灭菌方式为2qo NaClO溶液2min+0.1％HgCl2溶液5min，最佳的丛生芽分化诱导培养基为MS+3.0mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1NAA，最佳的继代增殖培养基为MS+2.5 mg.L-16-BA+1.5 mg·L-1 KT+0.4 mg·L-1 NAA，最适的生根培养基为1/2MS+1.0 mg·L-1 IBA。白花悬钩子组培快繁技术体系的建立既可为白花悬钩子优质种苗的工厂化生产提供技术支持，又可为悬钩子属植物叶片组培快繁体系的建立提供参考依据。