基于转录组学和代谢组学解析番茄果实品质形成过程

苏璐璐 朱文莹 陈旭 王辉 曹依林 王富

摘要：本试验以‘Micro-Tom番茄为试材，对其绿熟期（CR）、转色期（BR）及红熟期（RR）果实进行转录组学及代谢组学分析。转录组学分析结果表明，CR至RR过程中果实内与可溶性糖相关的磷酸葡萄糖变位酶基因（PCM）、糖原磷酸化酶基因（CPH等下调，1，4-a-葡聚糖分支酶基因（SBE）、蔗糖合酶基因（SuSy/）等上调；参与抗坏血酸合成途径的CDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（CCP）、单脱氢抗坏血酸还原酶基因（MDHAR）一直呈现上调趋势；而参与叶绿素降解、类胡萝卜素合成的多数基因以及与细胞壁代谢相关的众多基因则呈现先上调后下调的趋势；番茄碱生物合成途径CAME家族基因呈先下调后上调的表达模式。代谢组学数据表明，与品质形成有关的D-果糖、古洛糖酸、异柠檬酸、L-谷氨酸和L-天门冬氨酸等在番茄成熟过程中含量呈现持续增加的趋势，L-苹果酸呈下降趋势，L-精氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸在BR至RR过程中增加明显；槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素在转色期明显增加。综合可见，‘Micro-Tom番茄果实成熟过程中，可溶性糖、有机酸、氨基酸、黄酮类化合物等代谢物积累及关键基因表达均发生了规律性变化，可初步解析番茄果实品质形成过程。

关键词：番茄；转录组学；代谢组学；果实品质

中图分类号：S641.201：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2023）02-0009-11

番茄是一种重要的蔬菜作物，2018年我国番茄栽培面积110.9万公顷，其中设施番茄面积64.2万公顷。随着人们生活水平的提高，番茄果实品质尤其是口感和风味品质受到更多关注，关于果实成熟过程中的品质形成机理已有较多报道，利用多组学手段分析番茄果实品质的相关研究成为近年来的研究热点。Lu等研究发现，番茄果实成熟受MADS-type转录反馈回路的调控。大规模番茄果实ChIP-chip和转录组数据的分析证实，RIN通过直接结合和激活与成熟相关的关键结构和调控基因ACS2/4、SGR1、Psy、Cel2、EXP1、PAL1、C4H、Loxc、AAT1、CNR、NOR、AP2a及其自身，在番茄果实成熟过程中发挥着重要作用。黄丽华等检测了樱桃番茄以及5份野生番茄的代謝物，并对其叶片和果实中有机酸、氨基酸及糖类含量进行了分析，结果显示樱桃番茄中含有丰富的营养成分，且除水分以外，各种营养成分均比大宗番茄高。Fraser等研究表明，番茄果实中番茄红素脱氢酶基因的表达与B-胡萝卜素、叶黄素等的含量密切相关。Moco等比较了番茄果肉和果皮间代谢物的差异，并建立了包含上百种代谢物的番茄代谢组数据库。Tieman等研究显示，番茄成熟果实中28种代谢物与其品质风味和口感显著相关，其中3-甲基丁醇可显著提高果实的甜感。

上述研究多以成熟番茄果实为主，但对番茄果实品质形成过程的研究目前鲜有报道，且番茄果实成熟过程中物质代谢及基因表达的变化是高度复杂的，要明确番茄果实品质形成的机理仍需要大量研究。本研究以‘Micro -Tom番茄为试材，对绿熟期、转色期及红熟期的果实进行转录组学和代谢组学分析，以明确番茄果实成熟过程中品质形成的代谢物基础和转录水平的变化，探索番茄果实品质形成过程，为番茄优质栽培和育种提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试番茄品种为‘Micro -Tom，由青岛农业大学番茄育种课题组提供。于2021年3-7月开展试验。将番茄种子洗净后播种于72孔穴盘中，置于青岛农业大学人工气候室，待幼苗长至三叶一心时移栽至直径12 cm的花盆继续培养，培养条件为光周期12 h光/12 h暗，光照强度8 0001x，温度25℃/18℃，空气湿度75%；分别在果实绿熟期、转色期和红熟期取样，将果实切碎，液氮冷冻，放于-80℃冰箱保存，待用。绿熟期、转色期和红熟期样品分别标记为GR、BR和RR。

1.2试验方法

1.2.1番茄果实转录组学测定及分析 取绿熟期、转色期、红熟期番茄果实混样进行转录组测序，每组处理设置3次生物学重复，提取RNA后进行纯化、建库，然后使用第二代高通量测序技术（NGS），基于Illumina测序平台进行文库的双末端（PE）测序，该部分工作由上海派森诺生物科技有限公司进行。将测序得到的数据进行基因的差异表达、GO富集及KEGG富集分析。

1.2.2转录组数据的qRT-PCR验证 采用So-larbio试剂盒，提取不同时期的番茄果肉总RNA，使用反转录试剂盒TaKaRa（北京宝日医生物技术有限公司）将总RNA反转录合成cDNA，以cDNA为模板、Actin为内参进行qRT-PCR。利用在线引物设计软件（https：//quantprime.mpimp-golm.mpg.de/）对所筛选的差异基因设计定量引物（表1），通过溶解曲线分析确认其特异性。qRT-PCR采用TaKaRa试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司），在罗氏定量PCR仪上完成，程序设置为：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环。所有试验均设置3个生物学重复，相对表达水平的计算方法为2-△△a法。

1.2.3番茄果实代谢组学测定及分析 取绿熟期、转色期和红熟期果实各6次重复共18个样本进行代谢组分析。该部分工作由上海派森诺生物科技有限公司进行，实验方法参照De Vos和San-gster等的方法。将得到的数据进行代谢产物的差异分析及KEGG富集分析。

2结果与分析

2.1不同时期番茄果实转录组学分析

2.1.1差异表达基因分析 3个时期两两之间共检测出18 601个差异表达基因（DEGs），其中GR与BR间（GR vs BR）存在6 537个DEGs，其中2 057个上调，4 480个下调；BR与RR间（BR vsRR）出现4 587个DEGs，其中2 042个上调，2 545个下调；GR与RR间（GR vs RR）检测到7 477个DEGs，其中2 247个上调，5 230个下调。而且GR vs BR与BR vs RR之间有2 269个相同的DEGs，GR vs BR与GR vs RR之间有4 537个相同的DEGs，BR vs RR与GR vs RR之间有2 870个相同的DEGs，而GR vs BR、BR vs RR与GR vs RR三者之间共有1 240个相同的DEGs（图1A）。

2.1.2差异表达基因的GO富集分析 GR vs BR的GO富集结果显示，在细胞组分方面，DEGs主要富集在细胞周边、细胞膜等条目上：在分子功能方面，主要富集在催化活性、单加氧酶活性等条目上：在生物过程方面，主要富集在碳水化合物代谢过程、单羧酸代谢过程等条目上（图1B）。BR vs RR的GO富集结果显示，在细胞组分方面，DEGs主要富集在光合系统、光合膜等条目上：在分子功能方面，主要富集在色素结合、叶绿素结合等条目上：生物过程方面主要富集在光合作用、蛋白质一发色团连接等条目上（图1C）。GR vs RR的GO富集结果显示，在细胞组分方面，DEGs主要富集在细胞外围、膜的固有成分等条目上：在分子功能方面，主要富集在色素结合、单加氧酶活性等条目上；在生物过程方面，主要富集在光合作用光系统中的光收集、光合作用光收集、次生代谢过程等条目上（图1D）。

2.1.3差异表达基因的KEGG富集分析 KEGG富集分析结果显示，GR vs BR共有1 247个差异基因注释在119个通路上，富集较为显著且与番茄果实品质形成相关的通路主要有植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、类黄酮生物合成等通路（图2A）；BR vs RR共有848个差异基因注释在109个通路上，富集较为显著的有植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸和天冬氨酸及谷氨酸的代谢、光合作用、类黄酮生物合成、果糖和甘露糖代谢等通路（图2B）；GR vs RR共有1 440个差异基因注释在117个通路上，其中1 111个差异基因被富集在87条代谢通路上，富集较为显著的有植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、糖酵解／糖异生、类黄酮生物合成等通路（图2C）。

番茄果实由绿熟向红熟转变的过程中，蔗糖和淀粉代谢通路中的蔗糖磷酸合酶基因随着果实的成熟一直呈现上调趋势：参与抗坏血酸合成途径的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（CCP）、单脱氢抗坏血酸还原酶基因（MDHAR）一直呈现上调趋势：苯丙烷生物合成途径中合成木质素和柚皮素的反式肉桂酸4-单加氧酶表达呈现先上调后下调的趋势：类黄酮生物合成中5-0-（4-香豆酰）-D-奎宁酸3-单加氧酶基因、查尔酮合酶基因表达先上调后下调：另外在糖降解及其他代谢途径中的一些与果实品质形成相关的基因如糖原磷酸化酶基因（GPH）、磷酸葡萄糖变位酶基因（PGM）、异柠檬酸脱氢酶基因、谷胱甘肽生物合成酶基因也有不同程度的表达差异。

在果实由绿熟到转色再到红熟的过程中，与叶绿索降解关键基因SGRI、PPH均呈先上调后下调的趋势：由绿熟期向转色期转变的过程中，与类胡萝卜素生物合成相关的基因PSY1、PSY2、CRTISO、ZDS、PDS、BCH2、ZEP、NSY以及与细胞壁代谢相关的基因ExpJ、PC、PL、TBG4、CelJ、Cel2、XyL1等均呈现上调的趋势：与次级代谢产物形成相关的基因PAL、Tom LoxC、PPEAT、AAT1、FLORAlA、LIP8等均表现为先上调后下调的趋势：多个参与花青素合成的基因如CHS1、CHI、F3H、F3'5'H、UGTs、F3HL等均表现为下调；参与生物碱合成的GORKy、SAMT以及GAME家族基因GAME1、CAME4、GAME5、GAME6、GAME11、GAME12、GAME17、CAME18均呈现先下调后上调的趋势：另外参与调控果实成熟与果实品质形成的相关转录因子在果实成熟过程中表达量也发生了较大的变化，如RIN表现为持续上调，NAC4、NAP2表现为先上调后下调的趋势。

2.1.4 qRT-PCR验证结果 为了验证转录组数据的准确性，我们筛选了12个差异表达基因，利用qRT-PCR对其进行表达分析，结果表明，尽管转录组数据与qRT-PCR数据之间存在倍数上的差异，但是各个基因表达模式基本一致（图3），这表明获得的转录组数据是可信的，可以用于后续分析。

2.2不同时期番茄果实代谢组分析

2.2.1差异代谢物分析 结果发现，GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR共鉴定出154种主要差异代谢物。其中GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR分别存在138、103、144种差异代谢物，上调的分别有95、76、105种，下调的分别有43、27、39种。

差异代谢物中与番茄果实品质形成相关的重要糖类、有机酸、氨基酸、类黄酮等物质在番茄果实发育过程中的含量变化如表2所示。有机酸中反式肉桂酸在番茄果实成熟过程中呈现持续下降的趋势，异柠檬酸在果实发育过程中持续增加，L-苹果酸在果实由BR至RR发育过程中明显下降。氨基酸类化合物中的L-谷氨酸和L-天门冬氨酸在发育过程中逐渐增加，L-精氨酸、L-色氨酸、L-蛋氨酸在BR至RR转变过程中明显增加：槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素在转色期明显增加：糖类物质D-果糖、D-麦芽糖在番茄果实从GR到BR的过程中含量增加。

2.2.2差异代谢产物的KEGG富集分析 利用KEGG数据库和MetPA数据库对果实不同时期差异代谢物参与的代谢通路进行富集。GR vs BR、BR vs RR、GR vs RR的差异代谢物均富集到50多条代谢通路，并且共同富集到的与品质形成相关的代谢通路主要有类黄酮生物合成和柠檬酸盐循环途径（图4）。GR vs BR和GR vs RR所富集的与品质形成相关的代谢通路还包含有谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢，以及淀粉和蔗糖代谢等途径。另外，BR vs RR还富集到磷酸戊糖途径等。

3讨论与结论

如何提高番茄果实品质以及探究提高番茄果实品质的分子机理已成为热门研究课题。番茄果实中可溶性糖及有机酸的种类、含量、比例以及次生代谢物（多酚、挥发性有机化合物和生物碱）的种类和含量在果实成熟过程中均会发生较大的变化，这也对番茄果实口感及风味品质的形成起着决定性作用。本研究采用转录组学与代谢组学相结合的方法，通过研究不同时期番茄果实中糖类、有机酸、氨基酸、维生素、色素等物质及相关代谢通路的變化，初步探索番茄成熟后果实品质形成的原因。

前人研究表明，番茄果实可溶性糖含量随果实发育和成熟会发生明显变化，且含糖量在一定程度上会影响果实的硬度和挥发性香气物质，是影响果实品质的重要因素。果糖和葡萄糖是成熟番茄果实中的主要可溶性糖，蔗糖合成酶、酸性转化酶和蔗糖磷酸合成酶是参与蔗糖代谢的重要酶，在果实中糖的积累中起重要作用。本研究中，番茄果实中的氨基葡萄糖含量从绿熟期到转色期再到红熟期呈现不断升高的趋势，在红熟期达到最高：影响糖降解的磷酸葡萄糖变位酶基因、糖原磷酸化酶基因下调，控制合成糖原和海藻糖的1，4-a-葡聚糖分支酶基因（SBE）、介导蔗糖从韧皮部向果实输送的SUT1基因（蔗糖转运蛋白基因）以及控制蔗糖卸载的基因SuSyJ（蔗糖合酶基因）在果實成熟过程中也呈现上升的趋势：AGPL1在果实由转色期向红熟期转变过程中也显著上调，该基因调控果实成熟过程中的淀粉含量，促进可溶性固形物含量的增加。说明番茄果实由绿熟向红熟转变的过程中，己糖的合成、积累以及输送和卸载相关通路的关键基因表达量的变化，最终导致果实内糖分含量的增加，为番茄果实口感品质的形成奠定了物质基础。

果实内有机酸的种类和含量对番茄果实口感也非常重要，在果实发育过程中，有机酸的总含量呈现降低趋势。抗坏血酸是番茄果实品质中重要的指标。目前已报道的抗坏血酸生物合成途径有4种：L-半乳糖途径、古洛糖途径、D-半乳糖醛酸途径以及肌醇途径。古洛糖途径是在酶的作用下，将GDP-D-甘露糖经一系列反应催化生成古洛糖酸，最后生成抗坏血酸：岳东的研究证明了这条途径的准确性。本研究中，作为中间产物的古洛糖酸在整个发育时期含量持续增加，为番茄果实中抗坏血酸的合成提供了充足的底物：参与抗坏血酸合成途径的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因（GGP）、单脱氢抗坏血酸还原酶基因（MDHAR）也一直呈现上调趋势。前人研究显示，番茄果实中抗坏血酸含量在绿熟期至转色期显著增多，转色期后上升速度逐渐下降：苹果酸含量在番茄果实的整个发育阶段都呈现逐渐降低的趋势。本试验结果显示‘Micro-Tom番茄果实成熟过程中苹果酸含量一直呈现下降趋势，与前人研究结果基本一致。由上述结果我们推测，‘Micro-Tom番茄果实发育的整个过程中糖类物质含量上升，酸类物质总量下降，果实糖酸比值增加，番茄口感逐渐提升，是番茄果实品质形成的重要原因。

挥发性芳香物质的组分及含量是番茄果实的重要特征品质指标，主要由萜烯、醛、醇、酯、酮等复杂混合物组成。根据不同的前体，挥发性有机物可以分为四大类：脂肪酸挥发物、氨基酸衍生的挥发物、萜类挥发物以及类胡萝卜素衍生的挥发物。本试验代谢组学分析结果显示，番茄果实由转色期到红熟期转变的过程中，大部分氨基酸的含量呈现先下降后上升的趋势，氨基酸为芳香化合物合成的主要前体物质，果实绿熟期到转色期过程中多数氨基酸含量下降，可能是因为绿熟期积累的氨基酸到了转色期后主要进入下游途径合成芳香化合物。RNA-seq数据显示，与脂肪酸挥发物生物合成相关的基因LIP8、TomLoxG、Lecithin：cholesterol在果实成熟过程中表达量呈现上调趋势，这些基因均与短链脂肪酸衍生物的合成密切相关：与氨基酸衍生的挥发物生物合成相关的基因FLORAIA、AA DC1也呈现不同程度的上调。该结果也进一步证实了‘Micro-Tom番茄果实成熟过程中，氨基酸、脂肪酸的降解与代谢通路中关键基因表达水平的变化有关，促使果实中的挥发性芳香物质逐渐积累并散发，最终决定番茄果实成熟后香味品质的形成。

颜色作为番茄果实外观品质的最重要性状之一，在果实成熟过程中发生着显著变化，随着叶绿素的降解和类胡萝卜素／类黄酮的生物合成，最终形成番茄果实独特的颜色。本研究发现，‘Mi-cro- rom番茄果实成熟过程中胡薄荷酮、槲皮素-3-0-葡萄糖苷、柚皮素、橙皮素等与果实颜色形成相关的代谢产物呈现上调趋势，参与叶绿素降解的基因SCRJ、PPH以及参与类胡萝h素合成的基因PSY1、PSY2、CRTISO、ZDS、PDS、BCH2、ZEP、NSY在果实成熟过程中均呈现先上调后下调的趋势，由此推测‘Micro -Tom番茄果实成熟过程中果实叶绿素的降解和番茄红素的合成主要发生在绿熟期向转色期转变的过程中，且随着果实的成熟，叶绿素降解和番茄红素合成的速度逐渐减弱。

综上所述，通过对不同成熟时期番茄果实的代谢组学及转录组学分析，发现番茄果实从绿熟期向红熟期转变过程中，果实内可溶性糖、有机酸、氨基酸、黄酮类化合物、醇类、酚类等多种化合物含量和种类以及相关通路中关键基因表达水平发生明显变化，多种因素相互作用，形成了‘Micro-Tom成熟番茄果实的品质。本研究为番茄品质调控和优质番茄生产提供了理论依据。