非小细胞肺癌组织PRRX1、HOXC8表达及其临床意义

邹裕海,符仕康,刘 雨,梁必雄

海南西部中心医院胸外科,海南儋州 571700

非小细胞肺癌(NSCLC)包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌和大细胞癌,占所有肺癌的80%以上[1]。目前,NSCLC的发病率正在增加,由于肺癌细胞的侵袭和转移,NSCLC患者的生存率仍然很低[2-3]。有研究显示,NSCLC的侵袭和转移与上皮间质转化(EMT)密切相关,EMT与多种信号通路有关,在肿瘤发生发展中起着决定性作用[4]。配对相关同源框蛋白 1(PRRX1)属于配对同源框家族,PRRX1可作为转录因子调控多种基因表达。目前研究显示,PRRX1表达下调后,上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达降低,削弱了细胞间接黏附性,有利于促进癌细胞从原发部位脱离,促进了恶性肿瘤中EMT作用及肿瘤转移[5]。有研究表明,多种实体肿瘤侵袭和转移均与HOX基因表达有关[6]。同源盒C8(HOXC8)属于HOX基因簇的重要成员,是恶性肿瘤进展中EMT的标志物[7]。本研究旨在探讨NSCLC患者癌组织中PRRX1、HOXC8的表达及其临床意义,现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年5月至2017年5月本院收治的120例NSCLC患者为研究对象,癌组织及癌旁组织(距离肿瘤3～5 cm)标本在手术切除后保存于10%的中性福尔马林溶液中固定24 h,然后进行组织脱水,制备石蜡包埋切片。120例NSCLC患者中男83例,女37例;年龄38～80岁,平均(65.75±9.16)岁;肿瘤最大径1.3～7.0 cm,平均(5.21±1.75)cm;肺鳞状细胞癌75例,肺腺癌45例;高/中分化55例,低分化65例;TNM分期Ⅰ～Ⅱ期86例,ⅢA期34例;淋巴结转移63例。纳入标准:(1)经手术切除后病理证实为NSCLC,且为首次确诊患者;(2)年龄18周岁或以上,自愿签署知情同意书者。排除标准:(1)严重心肝肾功能障碍;(2)患免疫系统、血液系统疾病;(3)入院前近6个月内有大手术史;(4)患其他部位的原发性肿瘤;(5)既往有精神障碍史。本研究方案获本院伦理委员会批准。

1.2方法 采用免疫组化法测定NSCLC组织、癌旁组织中PRRX1、HOXC8、 EMT相关标志物E-cadherin和波形蛋白(Vimentin)表达情况。所有组织标本均经10%的中性福尔马林溶液固定,液体石蜡包埋标本置于模具中。将代表性蜡块切成4 μm厚连续切片,所有病理组织切片用二甲苯和梯度酒精脱蜡,然后用蒸馏水冲洗这些切片10 min。将组织切片浸入柠檬酸钠缓冲液 (pH 6.0) 中,高压锅煮沸后冷却至37 ℃进行抗原修复。为了抑制内源性过氧化物酶并进行组织抗原修复,将3%过氧化氢溶液逐滴加入到所有切片中,然后将切片在室温下孵育15 min。用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.2) 清洗载玻片3次,每次3 min。将切片置于孵育箱中,加入几滴小鼠单克隆抗PRRX1(稀释比例1∶150,北京傲锐东源生物科技有限公司),小鼠单克隆抗HOXC8(稀释比例1∶150,北京傲锐东源生物科技有限公司),兔单克隆抗E-cadherin(稀释比例1∶200,西格玛奥德里奇公司) 和抗Vimentin(稀释比例1∶200,英国Abcam公司) 抗体,然后将其置于37 ℃培养箱中1 h。之后 PBS洗涤切片3次,每次9 min,滴加二抗羊抗兔/小鼠IgG-HRP,室温放置30 min。将所有切片浸入新制备的 DAB 溶液中,用苏木精复染,用蒸馏水冲洗,用梯度酒精脱水并用中性树脂密封。免疫组化结果由两位病理科医师判定,每个组织标本须至少观察1 000个肿瘤细胞。阳性染色均为淡黄色、棕黄色或棕褐色,定位于细胞质。评分采用二级计分法[8]:(1)按阳性细胞所占比例计数,其中阳性细胞数<5%计0分,5%～<25%计1分,25%～<50%计2分,50%～<75%计3分,≥75%计4分;(2)按染色强度分类,其中无着色计0分,淡黄色计1分,黄或深黄色计2分,褐或棕褐色计3分。将两者计分相乘,乘积≥3分为阳性表达,反之则为阴性表达。

1.3预后随访 出院后随访5年,随访截止时间为2022 年5月。术后1年内每3个月复查一次,1年以后改为6个月复查一次。出院后同时通过电话、短信、微信等多种形式随访。

2 结 果

2.1NSCLC患者癌组织、癌旁组织中PRRX1、HOXC8及EMT相关标志物表达率比较 NSCLC患者癌组织PRRX1、E-cadherin阳性表达率低于癌旁组织,HOXC8、Vimentin阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 NSCLC患者癌组织、癌旁组织中PRRX1、HOXC8及EMT相关标志物表达率比较[n(%)]

2.2NSCLC患者PRRX1、HOXC8表达与E-cadherin和Vimentin蛋白表达的相关性分析 PRRX1表达与E-cadherin表达呈正相关(P<0.05),与Vimentin表达呈负相关(P<0.05)。HOXC8表达与E-cadherin表达呈负相关(P<0.05),与Vimentin表达呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 PRRX1、HOXC8表达与E-cadherin和Vimentin蛋白表达的相关性分析

2.3NSCLC患者PRRX1表达与临床病理特征的关系 PRRX1阳性表达患者肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期为ⅢA期、淋巴结转移占比低于PRRX1阴性表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 NSCLC患者PRRX1表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4NSCLC患者HOXC8表达与临床病理特征的关系 HOXC8阳性表达患者肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期为ⅢA期、淋巴结转移占比高于HOXC8阴性表达患者,差异有统计学意义(P<0.05)。HOXC8阳性表达患者性别、年龄、组织病理类型、分化程度与HOXC8阴性表达患者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 NSCLC患者HOXC8表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.5不同PRRX1、HOXC8表达患者的预后比较 随访5年,随访期间失访5例,其中PRRX1阳性表达患者失访2例,阴性表达患者失访3例。HOXC8阳性表达患者失访3例,HOXC8阴性表达患者失访2例。PRRX1阳性表达患者5年总体生存率[69.05%(29/42)]高于阴性表达患者[36.99%(27/73)],差异有统计学意义(χ2=4.956,P=0.026)。HOXC8阳性表达患者5年总体生存率[39.47%(30/76)]低于阴性表达患者[66.67%(26/39)],差异有统计学意义(χ2=6.974,P=0.008)。见图1、2。

图1 不同PRRX1表达患者Kaplan-Meier生存曲线图

图2 不同HOXC8表达患者Kaplan-Meier生存曲线图

2.6NSCLC患者预后的COX风险回归模型分析 将相关变量纳入COX风险回归模型,以NSCLC患者预后为因变量X(生存=0,死亡=1),多因素COX风险回归结果提示肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期ⅢA期、淋巴结转移、HOXC8阳性表达为预后的危险因素(P<0.05),PRRX1阳性表达是预后的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 NSCLC患者预后的COX风险回归模型分析

3 讨 论

NSCLC是呼吸系统最常见的原发性肿瘤,整个疾病发展涉及复杂多变的基因网络调控,会导致一系列基因或蛋白表达的结构或者功能异常[9]。尽管该疾病的多学科诊断和治疗方法显著提高,但NSCLC的早期诊断率和预后仍不理想。因此充分了解其中的分子机制对于指导临床诊断和治疗有重要意义。癌症发展过程中,癌细胞可能重新激活处于休眠状态的胚胎程序性EMT,EMT是肿瘤侵袭、转移的关键所在,可从多方面介入和促进肿瘤的疾病进程[10]。经历EMT后,肿瘤细胞能够穿透Matrigel胶进行浸润性生长,并诱导细胞微环境促进肿瘤生长,还可能导致免疫抑制,提高肿瘤干细胞表面标志物表达,促进肿瘤进展[11]。在NSCLC中,癌细胞转移也与EMT相关,EMT程序主要调节因子是通过激活或抑制启动子来控制EMT相关基因转录[12]。

PRRX1属于配对同源盒家族,可作为转录因子调控各种基因。PRRX1作为新的EMT 诱导剂,可通过调节E-cadherin、Vimentin诱导细胞EMT[13]。FELDMANN等[14]研究显示,PRRX1高基质表达的胰腺癌患者最具侵袭性。BLOCK等[15]在三阴性乳腺癌模型中的研究发现,RNA结合基序单链相互作用蛋白3 (RBMS3)与乳腺癌中的EMT转录程序显著相关,而PRRX1是RBMS3介导的EMT所必需蛋白,这也提示PRRX1与乳腺癌中的EMT转录程序有关。本次研究中,NSCLC癌组织中PRRX1阳性表达低于癌旁组织,肿瘤最大径≥5 cm、TNM分期为ⅢA期、淋巴结转移患者PRRX1阳性表达率占比更低,提示NSCLC组织中PRRX1阳性表达下降,且PRRX1阳性表达可能与抑制淋巴结转移有关。目前已有研究证实,E-cadherin、Vimentin与NSCLC疾病进展及预后密切相关[16]。E-cadherin表达缺失、Vimentin表达上调是肿瘤进展中EMT的标志。本研究结果显示,PRRX1表达与E-cadherin表达呈正相关,与Vimentin表达呈负相关,这也进一步提示PRRX1表达可能通过EMT参与NSCLC进展。在不同的恶性肿瘤中,PRRX1的表达水平与患者预后的关系有明显差异。在胃癌的相关研究中,PRRX1的高表达预示着预后较差[17]。然而,FAN等[18]在肝细胞癌的研究中却显示,PRRX1表达下调可通过p53依赖的信号通路,导致预后不良。本研究Kaplan-Meier分析也发现,PRRX1阳性表达患者5年总体生存率高于阴性表达患者。COX风险回归模型分析也显示,PRRX1阳性表达是预后的保护因素。PRRX1阳性表达与E-cadherin阳性表达呈正相关,与Vimentin阴性表达呈负相关,提示PRRX1阳性表达可促进E-cadherin再表达,抑制Vimentin表达,进而影响EMT过程,抑制癌细胞侵袭和迁移。

HOXC8是HOX家族的一员,已被发现在多种癌症中表达失调,并作为转录激活因子或抑制因子调节许多基因转录[19]。有研究表明,HOXC8与E-cadherin启动子结合,并作为转录抑制因子调节肺癌中的E-cadherin转录,E-cadherin的缺失导致肺癌癌细胞锚定非依赖性生长和迁移的增加[20]。本研究结果显示,NSCLC患者癌组织HOXC8阳性表达率高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),而且HOXC8阳性表达与肿瘤最大径、TNM分期为ⅢA期、淋巴结转移有关。HOXC8表达与E-cadherin表达呈负相关,与Vimentin表达呈正相关。Kaplan-Meier分析发现,HOXC8阳性表达患者5年总体生存率低于阴性表达患者,COX风险回归模型分析也显示,HOXC8阳性表达、肿瘤最大径增大、TNM分期越高、淋巴结转移为预后的危险因素。分析可能与HOXC8调节EMT相关基因的表达促进NSCLC增殖、迁移有关。E-cadherin表达缺失是EMT的关键一环,可增加癌症患者肿瘤细胞的迁移和侵袭。Vimentin是间充质细胞的标志物之一,与癌细胞侵袭和迁移能力增强密切相关,可作为肿瘤发生转移的标志之一[21]。HOXC8阳性表达,可抑制E-cadherin阳性表达,促进Vimentin阴性表达,预示患者预后不良,进一步表明HOXC8与NSCLC肿瘤转移、侵袭有关,或可作为预测患者生存预后的指标。

综上所述,NSCLC患者癌组织中PRRX1阳性表达率下降,HOXC8阳性表达率升高,且与EMT有一定相关性。HOXC8阳性表达为预后的危险因素,PRRX1阳性表达是预后的保护因素,有望作为判断NSCLC预后的标志物。