幽门螺杆菌抗生素耐药检测方法的研究进展

于宏璐,苏东帅,马韶泽,祁兴顺

于宏璐,苏东帅,马韶泽,祁兴顺,北部战区总医院消化内科 辽宁省沈阳市 110840

于宏璐,大连医科大学研究生院 辽宁省大连市 116044

苏东帅,中国人民解放军联勤保障部队第九六三医院 黑龙江省佳木斯市 154000

0 引言

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种革兰氏阴性杆菌,可经口-口、粪-口等途径在人与人之间传播,其在全球感染率约为50%,在我国可达44.2%[1,2].H.pylori感染与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关,因此,根除H.pylori对上述疾病防治具有重要意义[3].目前我国指南对于H.pylori的治疗推荐铋剂四联疗法,即1种质子泵抑制剂+2种抗生素+1种铋剂[4].然而,随着抗生素的大量使用,克拉霉素(Clarithromycin,CLA)、甲硝唑(Metronidazole,MTZ)和左氧氟沙星(Levofloxacin,LVX)耐药率均超过30%,MTZ甚至高达78%,使得经验性含铋剂四联方案的根除成功率很难达到90%[5,6].抗生素耐药是导致H.pylori根除失败的主要原因,常表现为三种模式,包括单药耐药、多重耐药和异质性耐药[7].单药耐药指H.pylori仅对一种抗生素耐药;多重耐药指H.pylori同时对两种或两种以上抗生素耐药;异质性耐药指同一亚群内或不同亚群H.pylori对抗生素的敏感性不同.了解H.pylori对抗生素耐药情况可帮助医生合理化应用抗生素,进而提高H.pylori根除率.传统检测是H.pylori抗生素耐药的常用检测方法,即先细菌培养再行药敏试验.随着分子生物学技术发展,各种新兴技术不断应用于H.pylori的耐药检测,方法选择逐渐多样化,包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及其相关技术、DNA测序、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、基因芯片等.本文旨在通过回顾相关文献,介绍上述检测方法优缺点及应用现状,为医生在临床实践中选择H.pylori抗生素耐药检测方法提供参考.

1 基于细菌培养的传统检测方法

H.pylori耐药的传统检测方法是基于细菌培养进行的.药敏试验包括琼脂稀释法、浓度梯度(E-test)法、纸片扩散法和微量肉汤稀释法.一项随机对照研究将90例胃活检H.pylori培养阳性的患者分为试验组和对照组,试验组根据E-test结果接受四联治疗,对照组采取经验四联治疗,发现试验组根除率显著高于对照组(意向性分析:91%vs73%,P=0.027;符合方案分析:95%vs79%,P=0.021)[8].一项前瞻性研究共纳入200例单次或多次H.pylori根除失败的患者,根据药敏结果给予三联或铋剂四联治疗,研究发现H.pylori总体根除率可达94.5%[95%置信区间(confidence interval,CI): 90.4%-97.5%][9].由此可见,药敏试验指导的个体化治疗可提高H.pylori根除率.目前,基于细菌培养的药敏试验是检测H.pylori对所有常用抗生素耐药性的唯一方法,对诊断H.pylori耐药具有重要作用,但仍存在以下缺点: (1)H.pylori细菌培养需基于内窥镜检查并取材,为侵入性检查方法,且培养所需时间长,可达1 wk-2 wk;(2)细菌培养的阳性率易受保存、运输方式及菌株接种浓度等因素影响[10];(3)药敏试验尚无标准的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值,结果可因不同标准的MIC值产生差异;(4)琼脂稀释法耗材、耗时,E-test法耗材昂贵,纸片扩散法尚缺乏统一判断标准,微量肉汤稀释法技术难度大[11].综上,传统的基于细菌培养的耐药检测方法虽可指导个体化治疗,但其不足之处限制了其在临床的应用.

2 分子生物学检测方法

2.1 PCR及其相关技术

2.1.1 PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP): PCR-RFLP是最早应用的一种常规PCR技术,原理为先利用特定引物扩增H.pylori可能的基因突变片段,再使用限制性内切酶对产物进行酶切,最后对酶切产物行电泳分析其长度,进而判断有无突变.PCR-RFLP通过基于胃活检的细菌培养及直接取材获取H.pylori基因片段.Khashei等[12]在100株H.pylori临床分离株中,共发现20株H.pylori发生23S rRNA突变,其中18(90%)株A2142G位点突变和2(10%)株A2143G位点突变,与E-test所得CLA耐药结果一致;Hussein等[13]在38株耐CLA的H.pylori中检测23S rRNA基因突变,发现10(26.3%)株A2143G位点突变、14(36.8%)株A2144G位点突变、9(23.7%)株A2143G和A2144G双位点突变,其余5(13.2%)株无位点突变;Pourakbari等[14]在福尔马林固定石蜡包埋胃活检标本中分析H.pylori的23S rRNA基因突变情况,发现耐CLA菌株中A2143G位点突变率最高(50%),其次为A2142G位点突变(29%)和A2142C位点突变(21%).与传统检测方法相比,该技术可直接检测耐药基因突变位点,具有操作方便、灵敏度高及耗时短的优势.但该法结果依赖于已知的耐药机制,若H.pylori发生耐药进化,则无法检测;该方法的准确性易受操作人员技术水平、取材方式、酶切产物等因素干扰.

2.1.2 双启动寡聚核苷酸(dual priming oligonucleotide,DPO)-PCR: DPO-PCR属于多重PCR,无需限制性核酸内切酶,可同时检测H.pylori感染及其抗生素耐药性.目前,商业化试剂盒Seeplex®ClaR-H.pyloriACE已成功用于评估H.pylori对CLA耐药性.该试剂共包含3对特异性引物,分别用于扩增23S rRNA、检测A2142G和A2143G位点突变.Ong等[15]同时应用琼脂稀释法和DPO-PCR检测胃活检标本H.pylori的CLA耐药性,发现以药敏结果为对照时,该技术的灵敏度是76.4%、特异性是90.1%;Kwon等[16]也使用琼脂稀释法和DPOPCR共同检测胃活检标本中H.pylori的CLA耐药性,发现该技术的灵敏度和特异性分别是77.8%和95.5%.此外,Choi等[17]应用该技术在101例H.pylori感染患者中检测CLA耐药性,发现29例患者耐药,其中25例A2143G位点突变、4例A2142G位点突变.总之,与常规PCR相比,该技术省去酶切步骤而更加简便;与传统检测方法相比,该技术特异性强,无需细菌培养而更加快速.

2.1.3 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR): qPCR已实现了定性到定量的飞跃,主要是在PCR体系中加入荧光标记物,利用随PCR产物增加而荧光信号强度等比例增加的现象,进而实时检测荧光信号强度并在指数期依据标准曲线进行分析,从而实现对起始模板的定量[18].目前,多种试剂盒已成功用于23S rRNA耐药基因的检测,适用于胃黏膜、胃液、粪便等多种标本,其灵敏度高、特异性强.van den Poel等[19]以琼脂稀释法为金标准,发现RIDA®GENE HP assay试剂盒检测胃活检标本中H.pylori对CLA耐药的灵敏度为92%、特异性为97%.Pichon等[20]以E-test法为金标准,发现AmplidiagH.pyloriClariR试剂盒检测粪便标本中H.pylori对CLA耐药性的灵敏度和特异性分别为100%(95%CI: 88%-100%)和98.4%(95%CI:94%-99%).Redondo等[21]使用LightMix®RT-PCR试剂盒在粪便和胃活检标本上检测H.pylori的CLA耐药性,发现该法结果与E-test法的符合率可达95%.因此,在粪便标本中应用qPCR可避免侵入性取材,且成本低,但需注意因粪便标本中血红蛋白、多糖复合物及重金属等物质抑制PCR造成的假阴性结果[22].Binmaeil等[23]开发了一种多重qPCR技术,包含扩增ureA、23S rRNA、GyrA基因的特异性引物和探针,可同时检测H.pylori感染及CLA、LVX耐药性;在571例胃活检标本中,该技术检测H.pylori感染的灵敏度为96.4%、特异性为88.5%,检测CLA耐药的灵敏度为100%、特异性为98.7%,检测LVX耐药的灵敏度为100%、特异性为99.8%;因此,多重qPCR技术尤其适用于低载量和多重耐药情况下H.pylori的检测.综上,与传统检测方法相比,qPCR技术是一种简便、快速、灵敏度高、特异性强、适用于多种标本的检测方法;多重qPCR技术适用范围更广泛.

2.1.4 扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)-实时荧光PCR: ARMS-实时荧光PCR通过设计ARMS引物的3’末端碱基落在突变基因位置,在扩增时,链延伸只在特定等位基因模板链上进行,从而实现对突变基因的特异性检测[24].Zhang等[25]纳入了150例H.pylori根除失败的患者,分别用DNA测序、ARMS-实时荧光PCR和E-test法检测胃粘膜标本中H.pylori的CLA耐药性,发现DNA测序结果与该技术的符合率为98.7%;E-test结果与该技术的符合率为97.1%.此后,开发了多重ARMS-实时荧光PCR方法,其灵敏度和特异性高、价格成本低、从样本接受到分析完成仅需2 h.Li等[26]应用多重ARMS-实时荧光PCR在192例H.pylori感染患者胃活检标本中检测H.pylori的CLA、LVX耐药性,共发现耐药患者74例,其中23例(31.1%)耐CLA、21例(28.4%)耐LVX、30例双重耐药(40.5%);以Sanger测序为金标准时,该技术诊断CLA耐药的灵敏度、特异性均为100%;诊断LVX耐药的灵敏度、特异性分别为98.04%和95.04%;诊断多重耐药的灵敏度和特异性分别为100%和96.91%.Zhang等[27]也评估了该技术检测H.pylori耐CLA、LVX的准确性;以Sanger测序为金标准时,该技术诊断CLA耐药、LVX耐药和多重耐药的灵敏度分别为96%、95%和95%,特异性分别为93%、92%和95%.综上,与传统药敏检测相比,ARMS-实时荧光PCR技术大大缩短了检测时间;与Sanger测序相比,其成本更低;但ARMS引物设计依赖于明确的耐药机制.

2.1.5 数字PCR(digital PCR,dPCR): dPCR是一种绝对核酸定量分析法,通过在扩增过程终点观测荧光信号并利用泊松分布计算基因扩增阳性分区的比例,从而实现对目标核酸的定量[28].与qPCR相比,dPCR无需使用标准曲线进行分析,进而节省时间[18].微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)目前已用于检测H.pylori的23S rRNA基因.Talarico等[29]应用ddPCR技术检测了102例患者福尔马林固定石蜡包埋胃活检组织标本中的23S rRNA基因,45例(44%)有CLA耐药基因,其中12例有耐药等位基因、33例同时存在野生和耐药等位基因.Sun等[30]比较了在胃活检标本中应用E-test法、ddPCR技术与在粪便标本中应用ddPCR技术检测H.pylori感染者CLA耐药性的结果,发现三种检测方法高度一致;并在49例H.pylori感染者中比较了在胃活检与粪便标本中分别应用ddPCR技术检测CLA耐药的结果,发现35例(71%)患者CLA耐药基因型一致,两种方法检测结果不一致的原因可能是粪便标本中H.pylori载量低或假性混合基因型比例高.由此可见,ddPCR无需进行细菌培养,可直接在胃活检或粪便标本中检测H.pylori的耐药基因型,且检测异质性耐药情况尤为方便,但在粪便中应用该技术应警惕假阴性结果.与传统方法相比,ddPCR结果准确且更加迅速、简便;与qPCR相比,其耗时短且结果准确,但仍需进一步研究证实其实用性.

2.2 DNA测序 DNA测序是检测H.pylori耐药基因的金标准,通过对H.pylori进行全基因组分析,可以检测已知和未知耐药基因突变,也可验证其他分子检测方法的性能.Sanger测序为一代测序技术.Tian等[31]应用Sanger测序和琼脂稀释法检测了160例H.pylori感染者胃活检标本中的抗生素耐药性,发现Sanger测序与琼脂稀释法检测CLA、LVX与阿莫西林(amoxicillin,AMX)耐药的一致性分别为84.8%、70.5%和72.7%.此后,开发了焦磷酸测序也已用于检测H.pylori的23S rRNA基因突变.初等[32]建立了一种检测CLA耐药的焦磷酸测序方法,与Sanger测序相比,焦磷酸测序无需电泳、荧光标记,是一种快速、灵敏度高的检测方法.近年来,新一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术是继Sanger测序后的一次革命性技术进展,已成为DNA测序的主要方法.与Sanger测序相比,NGS是一种强大的高通量方法,时间-成本效益比和测序产量极大增加;与传统H.pylori耐药性检测方法相比,NGS结果更可靠[33,34].Subsomwong等[35]应用NGS技术发现H.pylori抗生素耐药基因发生了新突变,如23S rRNA的T248C位点突变和GyrA的D210N、K230Q等位点突变;Azzaya等[36]发现了23S rRNA的新突变位点A1410G、C1707T、A2167G、C2248T、C2922T.总之,DNA测序检测H.pylori耐药基因快速、准确,但其制备过程严苛、检测周期长及测序仪器昂贵,限制了临床应用,故尚未在临床上推广.

2.3 FISH FISH的原理是先用半抗原或荧光素分子修饰的核苷酸分子标记DNA(或RNA)探针,再将探针与目标序列杂交,通过含荧光素分子的抗体与探针特异性结合,最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况[37].Demiray-Gürbüz等[38]分别应用E-test法和FISH法在114例H.pylori培养阳性者中检测CLA耐药情况,研究发现,E-test法检测出耐药患者23例(20.2%),FISH法检测出耐药患者32例(28.0%),两种检测方法一致性为89.5%.Vazirzadeh等[39]应用E-test法和FISH法检测了83例H.pylori培养阳性患者的CLA耐药性,研究发现,两种方法检测结果一致性为95%.此外,FISH技术在检测H.pylori异质性耐药时更加便捷,单个活检标本上即可同时显示敏感与耐药菌群,直接获得结果[40].由此可见,与传统耐药性检测方法相比,FISH技术更加便捷、可靠及适用范围更广.此外,与PCR技术相比,FISH无需DNA制备,3 h即可获得结果,可在荧光显微镜下直观显示CLA耐药菌株,不易受DNA污染影响.总之,FISH检测技术是一种快速、方便、准确的耐药性检测方法,但其所需仪器价格高、获取标本方式单一、无法检测除CLA外的抗生素耐药性,故尚未广泛用于临床检测.

2.4 基因芯片 基因芯片的原理是将含有大量不同DNA或寡核苷酸片段的探针按规律排列在载体上,同时用荧光素标记待测样本核酸,然后将样本与芯片探针杂交,通过计算机扫描分析芯片荧光信号强度,进而获取样本核酸基因序列和表达水平信息.Yin等[41]在267例儿童患者的胃活检标本中应用了基因芯片技术,发现与药敏试验相比,该技术诊断H.pylori的灵敏度、特异性和准确性分别是96.1%、85.0%和93.6%;检测H.pylori耐药性的结果表明,耐CLA的主要位点是2143A/G、耐LVX的主要位点是GyrA 91和GyrA 87;并对药敏试验和基因芯片结果不一致的25个样本行DNA测序,发现该技术检测CLA、LVX耐药性与DNA测序一致率均高达95%.Song等[42]建立了一种可同时检测CLA、LVX耐药性和CYP2C19多态性的可视化基因芯片,以DNA测序为金标准时,发现该技术检测CLA耐药性的灵敏度、特异性及与DNA测序一致性分别为92.13%、93.75%和95.94%;当该技术检测LVX耐药性时,GyrA 87位点灵敏度、特异性及与DNA测序一致性分别为91.11%、98.20%和96.82%,GyrA 91位点灵敏度、特异性及与DNA测序一致性分别为91.23%、98.90%和98.26%.总之,基因芯片是一种灵敏度高、特异性强、准确、快速的检测方法,单张芯片即可一次性同时分析H.pylori对多种抗生素的多个耐药基因突变位点,但其价格昂贵、无法检测到数目小于100拷贝的待测基因;因此,目前并不适用于临床检测.可视化基因芯片为芯片技术的未来发展提供了新思路,准确性与DNA测序相当,成本大幅下降,这为临床推广奠定了基础.

3 结论

H.pylori对抗生素的耐药形势严峻,通过耐药性检测实施个体化治疗的重要性日益突显.随着分子生物学技术发展,检测方法选择众多.传统检测方法费时费力,未在临床常规开展.分子生物学方法快速、准确,在临床研究中备受关注,但也并非完美.PCR的酶切、电泳步骤较繁琐;测序技术的仪器造价昂贵;FISH只可检测CLA耐药性;基因芯片技术的基因模板数目需达最低要求.因此,临床医生在选择检测抗生素耐药性方法时,应结合不同检测方法的优缺点、患者经济状况和临床实际等因素综合考量,选择适宜耐药性检测方法,以期减少H.pylori耐药性并提高根除率.目前仍需开发快速、简便、准确、价廉的H.pylori抗生素耐药性检测方法.