CSIA在有机污染物生物降解中的应用进展及文献计量学分析

郭 瑶，王 莹，梁继东

（1. 国家能源集团 神东煤炭集团有限责任公司，陕西 榆林 719300；2. 西安交通大学 环境科学与工程系，陕西 西安 710049）

有机污染物广泛存在于环境中，生物修复技术在有机污染场地的修复方面展现出巨大的应用潜力［1］。评估有机污染物的生物降解程度、解析有机污染物的生物降解机理，在受污染土地管理、风险评估和生物修复措施确定等方面具有重要意义，而科学、准确、高效地定量化分析污染物的降解效率是其前提保障。目前常采用气相色谱（GC）或气相色谱-质谱（GC-MS）法对有机污染物进行定量分析，但需预先用特定溶剂进行萃取。该方法存在以下问题：1）有机污染物中可萃取和不可萃取的成分是不确定的，特别是对于污染复杂且时间较长的环境样品；2）环境样本中一部分先前不可萃取的化合物经生物降解后转化为可萃取成分；3）有机污染物的降解受到赋存环境等诸多因素的影响，会发生物理、化学和生物转化，其中生物转化又涉及同化、异化及部分中间代谢产物再分解等过程，受环境因素干扰较大［2-3］。20世纪90年代发展起来的单体稳定同位素分析（compound-specific stable isotope analysis，CSIA）技术，可克服上述问题，已逐渐被应用于环境分析领域，成为目前研究有机污染物环境行为的新技术［4-5］。CSIA能够为有机污染物的来源及生物降解提供精确信息，因而受到越来越广泛的关注［6］。例如，对碳氢化合物生物降解过程中碳和氢稳定同位素进行联合分析，可量化同位素组成并推断特定物质在环境中的来源和命运。该方法不仅能区分有机污染物的来源，还能识别和量化转化反应。

文献计量学是指将数学和统计学的方法运用于文献及其他交流介质研究的一门学科。它能够在海量的文献数据中通过定量和模型分析客观展示出学科的研究现状并推测其未来发展趋势。虽然目前关于CSIA技术分析生物降解机理的研究很多，但缺乏从文献计量角度对整体研究现状的系统回顾。因此，通过网络关系图对重要信息进行聚类分析并量化已发表的文献数据，对于了解CSIA技术应用于有机污染物生物降解领域的最新动态和发展趋势具有重要意义。

基于此，本文详细介绍了稳定同位素分析方法和CSIA技术的原理，并从Web of Science（WOS）数据库收集数据，利用引文分析软件CiteSpace对CSIA用于有机污染物生物降解领域的研究进行了文献计量学分析，以期为CSIA技术在实际场地的应用提供参考。

1 稳定同位素及其分析方法

原子由质子、中子和电子组成。具有相同质子数、不同中子数（或不同质量数）的同一元素的不同核素互为同位素。同位素可分为两大类，即放射性同位素（如14C）和稳定同位素（如12C和13C）。稳定同位素是指某元素中不发生或极不易发生放射性衰变的同位素。稳定同位素之间虽然几乎没有化学性质的差别，但其物理性质常有微小差异［7］。同位素组成常用同位素丰度表示，指在一种元素的同位素混合物中，某种特定同位素的原子数与该元素总原子数之比。在天然物质中，大多数元素的同位素组成具有恒定性［8］。例如，碳元素的两种稳定同位素12C和13C的自然丰度分别为98.89%和1.11%［9］。但是，自然条件下的多种作用不断对同位素进行分离，故随着样品来源环境的变迁，其同位素组成也在某一范围内变化。

有机化合物主要由碳（C）和氢（H）元素组成，也可能含有氧（O）、氮（N）、硫（S）、氯（Cl）等元素，这些元素均至少有两种稳定同位素。一般存在于自然界的某种元素，其同位素中轻同位素的相对丰度很高，而重同位素的相对丰度很低，例如氢元素。水是氢元素的主要来源，海水中氢（1H）的丰度为99.984 4%，而氘（2H）的丰度仅为0.015 6%［8］，这使得其同位素比值R（某一元素的重同位素丰度与轻同位素丰度之比）很小，不利于分析比较［9］。此外，通过不同实验室的仪器及同一台仪器的多次分析测得的同位素比值可能存在偏差。为了便于比较分析，国际上统一采用δ值（‰）表示某元素的同位素组成，指样品中某元素的同位素比值相对于国际参考标准物质同位素比值的千分差（见式（1））［10］。目前，碳同位素的国际参考标准物质是V-PDB（vienna pee dee belemnite），氢同位素的国际参考标准物质是V-SMOW（vienna standard mean ocean water）［11］。

式中，Rs和Rr分别为样品和国际参考标准物质中某元素的同位素比值。

δ值可通过GC-C-IRMS进行测定，该仪器由GC、中间连接装置（C，connection）和同位素比值质谱仪（IRMS，isotope ratio mass spectrometer）3个部分组成。中间连接装置可以是高温燃烧（氧化）炉或高温裂解（还原）炉。样品经GC分离后，进入高温燃烧炉（例如碳元素氧化）或高温裂解炉（例如氢元素还原），碳元素可被高温氧化为气态CO2，氢元素可被高温裂解还原为气态H2，然后待测气体（CO2或H2）通过接口进入IRMS分析［6］，便可获取样品中目标化合物特定元素的δ值。

2 CSIA技术定量分析有机污染物的原理

1994～1995年，MERRITT等［12-13］首次介绍了CSIA技术，运用GC-C-IRMS在线分析了混合有机物中各特定化合物（质量浓度为μg/mL级）的同位素组成，并探讨了该方法的稳定性、灵敏性、数据获取与校正、界面性能优化等问题。轻重同位素不同的零点能会引起量子力学效应的微小差异。一般而言，与重同位素相比，轻同位素因零点能更高而形成的化学键更弱［7］。轻重同位素形成的分子间化学键键能差异导致的同位素在不同化合物或不同物相间分布不均匀的现象称为同位素分馏［14-18］。CSIA技术可测定特定化合物中某元素的同位素比值（组成），进而可根据同位素分馏效应分析有机污染物的降解规律。

近年来的研究证明了某些污染物的生物转化会导致稳定同位素的分馏，基于此可构建生化反应过程中同位素组成与污染物浓度随时间变化的定量关系，进而可推测复杂环境中污染物的生物降解过程［19-22］。稳定同位素具有特征性和稳定性，可用于环境污染物生物降解的精确定量评估。在生物降解有机污染物过程中，可分析稳定同位素的动力学分馏，即由于分子反应位点上轻重同位素反应活性不同，动力学反应速率不同，导致的底物与产物中同位素分布不对等的效应［23-24］。而在生化反应中，同位素的动力学分馏会随酶催化反应的动力学而改变［25］。一般情况下，稳定同位素的动力学分馏可分为两类：一级动力学分馏，由同位素直接参与的化学键转换过程；二级动力学分馏，同位素参与的化学键不发生断裂但可能发生减弱或重新杂化的过程，且其在反应中是速率决定步骤。后者的反应速率常数通常比前者小一个数量级。由于氢同位素的质量差异较大，二级动力学分馏效应变化显著［26-27］。同位素分馏与反应动力学的关系可以用稳定同位素分馏因子α（重同位素的反应速率常数与轻同位素的反应速率常数之比）来表示［11］。

在生物降解过程中，同位素比值和残余底物浓度之间的关系可以用Rayleigh方程来描述（见式（2））［28-32］。一般而言，自然环境中轻同位素的丰度远高于重同位素，所以有R+1≈1，对式（2）进行了简化，得到式（3）。

式中：Rt和R0分别为在t和0时刻的底物同位素比值；ct和c0分别为在t和0时刻的底物浓度。

底物单位增量引起的同位素分馏变化量通常用同位素富集因子（ε，‰）来表征，ε与α的关系见式（4）。

结合式（1）和式（4），将式（3）用对数形式表示，得到式（5）。按式（5）进行线性拟合，ε为该线性回归方程的斜率［33］。

式中，δt和δ0和分别为t和0时刻测定元素的δ值。

利用同位素比值的变化评估有机污染物的生物降解率（B，%），见式（6）［34］。

3 文献计量学分析

为探明CSIA在有机污染物生物降解研究中的应用（2000年开始陆续出现相关报道）趋势，本工作以收录于WOS核心合集的文献（2000～2022年）为数据源，以“biodegradation”或“transformation”为关键词搜索与CSIA相关的论文，通过精确筛选获取179篇有效论文，再借助CiteSpace软件对精选文献进行计量学分析［35］，结果如下。

通过相关领域各发文国家的共现网络分析（见图1）发现，CSIA用于有机污染物生物降解与转化研究的论文主要集中于德国、美国、加拿大、瑞士、法国等欧美发达国家。最早通过该技术进行有机物生物降解研究的国家包括荷兰、美国和澳大利亚，这些国家从2000年开始有相关的研究论文发表，且发文数量随时间呈现递增趋势。我国起步较晚，从2010年后逐渐有相关论文发表。由此可见，欧美发达国家凭借环境学科整体先发优势及自有大型仪器设备，在学科前沿探索方面要领先于我国。21世纪10年代以来，随着我国经济的快速发展，研究资金和大型仪器进口力度加大，支持我国学者近十年来在相关领域研究的投入，呈现发文量大幅增长趋势。

图1 基于WOS检索CSIA用于有机污染物生物降解与转化研究的国内外发文量共现网络图（2000～2022年）

从国内外发文的研究机构共现网络图（见图2）可以发现，德国亥姆霍兹联合中心、加拿大多伦多大学和瑞士纳沙泰尔大学的论文发表数量和合作单位数量均居国际前列，这与这些国家的发文量优势是一致的，说明这些国家相关领域的研究相对集中于上述研究机构。美国虽然整体发文量位居国际前列，但没有突出的研究机构，说明相关领域研究分散于美国的不同研究机构中。我国的研究机构发文数量排名靠后，且与国际机构合作发文量少，这是因为我国在相关领域的研究起步较晚，尚未有研究机构形成优势，未来需要加强与国际领先机构的合作与交流。

图2 基于WOS检索CSIA用于有机污染物生物降解与转化研究的国内外机构共现网络图（2000～2022年）

从相关研究领域关键词共现网络图（见图3）可以发现，同位素分馏现象是CSIA用于有机污染物生物降解与转化规律探索的基础，研究污染环境对象主要涉及地下水和特定场地，研究的关键污染物包括氯乙烯、环己烷、叔丁基醚、胺类杀虫剂和芳香烃等，污染物降解途径主要涉及好氧和厌氧生物降解、自然衰减、还原脱氯等过程。

图3 基于WOS检索CSIA用于有机污染物生物降解与转化研究的关键词共现网络图（2000～2022年）

需要说明的是，本工作采用同样的方法检索中国知网（CNKI），但得到的研究型论文数量有限，不足以开展文献计量学研究，说明该领域仍属国际前沿研究。另外，国内相关研究机构除在国际期刊发声外，也应辐射中文期刊，为相关领域知识在国内更广泛的传播提供支持。

4 CSIA技术应用进展

CSIA技术已被应用于有机污染物生物降解程度的评估中［36-38］。有学者研究了好氧生物降解对原油正构烷烃氢同位素组成的影响，发现氢同位素分馏程度与烃链长度有关，并通过Rayleigh方程得到了C15～C18的α为0.981 1～0.996 2［39］。TANG等［40］将CSIA运用到3种模式的复合回流人工湿地（IRCWs）对毒死蜱的原位生物降解研究中，分析了添加植物和生物炭对毒死蜱生物降解的影响，并在不同的处理组中得到了不同的碳同位素富集因子ε（0.69‰±0.06‰，0.91‰±0.07‰，1.03‰±0.09‰）。XU等［41］通过CSIA得到了6种拟除虫菊酯在微生物降解过程中的碳同位素富集因子ε，其中溴氰菊酯（-2.00‰）、甲氰菊酯（-1.88‰）和顺式氯氰菊酯（-1.82‰）产生显著的碳同位素分馏效应，并据此建立了一种土壤中生物利用度的新估算方法。QIAN等［3］应用CSIA对污染土壤中六氯环己烷（HCH）同分异构体进行了生物降解研究，测定了不同污染场地土壤样品中HCH的浓度和碳同位素比值，得到了土壤中α，β，γ，δ-HCH生物降解的碳同位素富集因子ε，分别为2.0‰，1.5‰，3.2‰，1.4‰，这对于现场土壤中HCH同分异构体的原位生物降解定性和定量评价具有重要意义。

CSIA技术在有机污染物生物降解转化过程中另一大应用是判断有机污染物的降解途径。传统研究有机物降解机理的方法主要是依靠各种质谱手段（如GC-MS和LC-MS等），通过对中间产物的分析推测可能的降解途径。这种方法具有一定的缺陷，因为同一产物可能有不同的来源，仅仅通过中间产物不能准确推断降解机理［42-46］。有机污染物在生物转化过程中，不同转化途径中化学键的断裂和生成方式不同，这会产生不同的动力学同位素效应（kinetic isotope effect，KIE，与α互为倒数），因此可以通过KIE或ε得到降解机理的相关信息［6，47］。一般用CSIA技术测得的同位素组成包含了分子中某元素的所有原子，分子反应位点（原子）的同位素分馏变化量高于由测得的同位素比值计算得到的整体同位素分馏变化量，即存在“同位素稀释效应”，此时利用KIE或ε研究有机污染物的降解机理会使研究的准确性受到质疑［48］。为此，有研究者引入了具体反应位点的表观动力学同位素效应（apparent kinetic isotope effect，AKIE）这一概念，对同位素稀释效应进行校正，可更为合理地探讨环境中有机污染物的反应机理［9］。KÜMMEL等［28］通过氢同位素分馏的差异区分了萘和2-甲基萘的好氧和厌氧过程，并通过氢同位素的AKIE值探讨了不同降解过程中的生物降解途径。CHEN等［49］在含有阿特拉津氯水解酶基因（AtzA）的菌株中观察到正常碳和逆氮的同位素分馏程度较低。有机物被微生物代谢过程中，大部分情况下底物中含轻同位素的分子会被微生物首先利用，而在残余底物中含重同位素的分子得以富集，造成稳定同位素分馏，即正常的同位素分馏；但少数情况下存在相反的现象，即逆同位素分馏。氮元素得到逆同位素分馏，表明底物中重氮元素被利用，说明AtzA通过配位Cl和芳香族N从碳氯键中提取电子，从而促进亲核攻击，催化阿特拉津水解脱氯。ELSNER等［34］总结了不同亲核取代反应（C—C1，C—N，C—O键断裂）中C—H键和C=C键氧化反应的同位素分馏数据和不同类型反应的碳、氢稳定同位素的AKIE范围。

当参与反应的两个或多个原子包含多种元素时，可进行二维或多维CSIA，该方法能有效消除环境因素变化对同位素分馏的影响和对同位素的掩蔽，从而更好地进行降解机理解析［46］。BERGMANN等［50］报道了在苯的厌氧降解过程中测得的碳氢同位素富集因子：εC=-2.5‰±0.2‰，εH=-55‰±4‰（硫酸盐还原菌）；εC=-3.0‰±0.5‰，εH=-56‰±8‰（铁还原菌），从而计算得到双同位素富集因子（Λ）（Λ=20±2，17±1），与之前报道的硝酸盐还原菌相似。一般认为，对于苯厌氧降解，可用ε对兼性厌氧菌（反硝化）和严格厌氧菌（硫酸盐还原、发酵）进行区别，该研究结果打破了此前的观点。而CUI等［11］则利用好氧生物降解中碳和氢的同位素分馏得到喹啉和3-甲基喹啉的Λ值（分别为20±2和8±2），证明了底物特异性可能对喹啉类化合物生物降解的同位素分馏产生重要影响。

5 结语和展望

CSIA技术具有特征性和稳定性，可为环境污染物生物降解的精确定量评估提供有效手段，同时CSIA相较于传统的稳定同位素方法，也可以判断有机污染物的降解途径及降解机理，在有机污染物环境行为研究方面具有广泛且重要的应用前景。然而，有机污染物降解过程中并不是都会产生可观测的同位素比值变化，当特定污染物的特定元素同位素比值变化不明显时，采用单一元素的稳定同位素对环境污染物的降解行为进行分析会带来很大的不确定性。为了便于比较分析，二维CSIA甚至多维CSIA技术的应用极大可能成为该领域未来发展的趋势。另外CSIA技术作为一种新兴技术尚处于初级应用阶段，加之自然环境是一个复杂的系统，要想将CSIA技术应用到实际场地中，依然需要对各种环境过程中有机物同位素分馏效应进行进一步的研究解析，以获取精确的特征参数。