减氮配施生物有机肥对植烟土壤特性及烟草青枯病的防效研究

尹兴盛， 包玲凤， 濮永瑜， 孙加利， 张庆， 李海平，杨明英， 林跃平， 王怀鑫， 何永宏， 杨佩文*

（1.云南省烟草公司保山市公司，云南 保山 678000； 2.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；3.云南省农业科学院农业环境资源研究所，昆明 650205）

现代农业种植体系中，随着农业产业结构调整，在以烤烟为中心的作物轮作复种制度下，长期施用化肥加速了土壤养分消耗，并衍生板结、耕层变薄等次生障碍，导致土壤中病原菌剧增而引发严重根茎类病害[1]。以培育耕地地力和稳定提升肥料利用率为突破口，开展植烟土壤地力提升及养分利用增效机制和技术的多尺度研究，建立土壤地力提升、养分与有害生物间相互关系，研发基于耕地地力提升的有害生物生态防控新途径是实现病害可持续防控的重要方向。

生物有机肥能改善土壤耕层物理性状，增加有机质和养分含量，改变土壤微生物环境，促进土壤微生物功能多样性形成，是植烟土壤质量提升的有效措施。大量研究表明，生物有机肥的施用可以疏松土壤，增加土壤的孔隙度，改善土壤的团粒结构，提高土壤保水保肥性能和通气状况，还可以提升土壤有机碳、土壤酶活性和土壤微生物量碳氮等[2-5]。生物有机肥中含有大量易被微生物分解和利用的营养物质，可刺激不同微生物类群的迅速生长和繁殖；另外还含有大量功能微生物，功能微生物输入土壤后，其种类和数量的变化直接改变了土壤微生物的群落结构，促进了土壤微生物优势群落的形成[6‑7]；而土壤微生物量的增加进一步提高了蛋白酶、脲酶、蔗糖酶和土壤磷酸酶等的活性，从而影响土壤中氮、磷、钾等养分的矿化速率[8-10]。在当前减施化肥和增施有机肥的大趋势下，针对植烟土壤质量退化和病害频发问题，生物有机肥是改善耕作土壤环境和提高作物产量、质量及各项抗逆性能的重要农业生产投入品之一。

面向建立耕地大面积均衡减肥提质的技术需求，针对植烟区主要土壤类型，以消除土壤障碍制约和快速培育地力从而稳定提升地力为突破口，开展功能型微生物菌肥研发，并在植烟土壤开展减氮配施生物有机肥田间小区试验，通过分析土壤理化性质和生物学特性变化特征与主控因素，揭示减氮配施生物有机肥促进地力提升的效果。进一步通过解析土壤理化性质和生物学特性主控因素与病情指数间的相关关系，建立“稳定提升土壤质量-加速养分循环利用-生态防控根茎类病害”的综合管理模式，为植烟土壤氮素优化管理和病害防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试生物有机肥

取菌渣500 kg、中药渣200 kg、草炭300 kg 混合，堆好后用塑料布覆盖。堆捂期间控制堆肥物料中水分含量在35%~40%，温度在65~75 ℃，分别于堆捂第10、20、30 天翻堆1 次，在此过程中加入尿素、过磷酸钙和硫酸钾作为肥料添加剂，该肥料添加剂中N、P、K 的质量比为8∶16∶26，堆肥持续至第35 天时即获得有机肥。初级腐熟发酵结束后，加入10 kg 1.0×109CFU·g-1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），并翻堆使其混合均匀，次级发酵5~10 d，在此期间控制堆肥物料中水分含量介于25%~28%，温度介于35~50 ℃，分别间隔2 d翻堆1 次，即获得生物有机肥。其中，N含量19.82 g·kg-1，P2O533.78 g·kg-1，K2O 29.26 g·kg-1，有机质含量483.30 g·kg-1，多粘芽孢杆菌有效活菌数≥2.0×108CFU·g-1。

1.2 试验地概况

田间试验于2020年5—11月进行，试验地点位于云南保山市昌宁县柯街镇腊邑村（24°54´49″ N，99°24´40″ E），海拔145 m，全年平均气温19.5 ℃，年降雨量96 mm。土壤类型为砂壤，0—20 cm土壤容重1.67 g·cm-3，有机质35.26 g·kg-1，全氮1.98 g·kg-1，全磷1.02 g·kg-1，全钾19.07 g·kg-1，碱解氮168.74 mg·kg-1，有效磷40.11 mg·kg-1，速效钾312.58 mg·kg-1，pH 7.49。烟草青枯病历年发生，病情指数5.00~20.00。作物种植模式为烤烟-豌豆轮作。

1.3 试验设计

设置不同氮用量、相同生物有机肥用量田间小区试验，各小区随机排列，试验设置常规施肥（CK1）、常规施肥+农家肥（牛粪发酵而成，N 含量0.32 g·kg-1，P2O5含量0.25 g·kg-1，K2O 含量0.65 g·kg-1，有机质145.70 g·kg-1，施用量7 500 kg·hm-2）（CK2）、常规施肥减氮5%+生物有机肥（3 750 kg·hm-2）（T1）、常规施肥减氮10%+生物有机肥（3 750 kg·hm-2）（T2）、常规施肥减氮15%+生物有机肥（3 750 kg·hm-2）（T3）、常规施肥减氮20%+生物有机肥（3 750 kg·hm-2）（T4）共6 个处理，每个处理4 次重复，共计24 个小区。全部的农家肥和生物有机肥作为基肥（环状塘肥）施用，其他主要栽培技术参照当地烤烟标准化生产技术方案执行，烤烟品种为云烟系列云烟105。

1.4 指标测量

1.4.1土壤样品采集与分析 于烤烟收获后（2020年11月）采集土壤样品，分别制备新鲜样品和风干样品，测试土壤酶活性和主要理化指标。参照鲍士旦[11]的方法，土壤容重（bulk density，BD）采用环刀法测定；pH采用pH仪测定；有机质（organic matter，OM）含量采用重铬酸钾外加热法测定；全氮（total nitrogen，TN）含量采用凯氏定氮法测定，碱解氮（alkaline-ydrolyzed nitrogen，AN）含量采用碱解扩散法测定；速效磷（available phosphorus，AP）含量采用碳酸氢钠提取法测定；速效钾（available potassium，AK）含量采用盐酸浸提-AAS 法测定。土壤蔗糖酶（invertase，INV）和脲酶（urease，URE）活性采用试剂盒（苏州瑞思生物科技有限公司生产）微板法测定，测定方法按照试剂盒说明书进行。土壤碳储量（soil carbon storage，SCS）、土壤氮储量（soil nitrogen storage，SNS）的计算公式如下[12]。

式中，Nmass为土壤中全氮或有机碳储量（kg·hm-2），C为土壤全氮或有机碳含量（g·kg-1），B为土壤容重(g·cm-3)，H为土层厚度(m)。

土壤微生物量碳（soil microbial biomass carbon，SMBC）、土壤微生物量氮（soil microbial biomass nitrogen，SMBN）采用氯仿熏蒸-硫酸钾溶液浸提法测定[13]，计算公式如下。

式中，EC为熏蒸土壤浸提测定的总有机碳-不熏蒸土壤浸提测定的总有机碳；kEC为转换系数，取值0.38；EN为熏蒸土壤浸提测定的全氮-不熏蒸土壤浸提测定的全氮；kEN为转换系数，取值0.45。

1.4.2烤烟农艺性状和青枯病发生情况及产质量测试 烤烟农艺性状调查方法按YC/T 142—2010《烟草农艺性状调查测量方法》[14]标准调查。于烤烟收获期测定各区产量、等级和单价。烟叶经济性状按GB 2635—1992《烤烟》[15]对烤后烟叶进行分级，记录烟叶产量、产值、上等烟比例及均价，进行烟叶产量和经济效益统计。烟草病情分级标准参照GB/T 23222—2008《烟草病虫害分级及调查方法》[16]调查，计算病情指数和防治效果[17]。

1.5 数据分析

利用Excel 2010 对数据进行统计分析，采用SPSS 20.0软件进行方差分析，利用Duncan进行差异显著性检验，P<0.05为差异显著；采用SigmaPlot 12.5制作图表。

2 结果分析

2.1 不同施肥处理对植烟土壤主要理化性质的影响

不同施肥处理下植烟土壤理化性质见图1，CK2 和T2、T3、T4 处理的土壤容重显著低于CK1处理（P<0.05）；CK2 和T1~T4 处理pH 显著低于CK1 处理，土壤有机碳、土壤碳氮比（C/N）显著高于CK1 处理（P<0.05）；与CK1 相比，CK2 处理碱解氮含量显著提升，T1~T4 处理无明显变化；CK2、T1、T2、T4 处理速效钾含量显著高于CK1 处理，T3 处理无明显变化；各处理间有效磷含量无显著差异。与CK1 相比，T1~T4 处理土壤容重降低2.40%~7.31%，pH 降低3.58%~6.93%，C/N 提高11.71%~15.59%，有机碳提高19.76%~22.64%，碱解氮提高1.97%~3.50%，速效钾提高7.69%~15.51%。T1~T4 处理间土壤容重、pH、碱解氮先下降后趋于平缓，速效钾含量先减后增，有机碳含量、C/N、有效磷无明显变化。

图1 不同施肥处理下的土壤主要理化性质Fig. 1 Main physical and chemical properties of soil under different fertilization treatments

2.2 土壤碳氮储量统计分析结果

由图2 可知，增施生物有机肥处理土壤碳储量、氮储量显著高于单施化肥处理（P<0.05）。其中，CK1 处理土壤碳储量为42 400 kg·hm-2、氮储量为4 400 kg·hm-2，CK2 处理的碳储量为54 900 kg·hm-2、氮储量为4 900 kg·hm-2，T1~T4 处理碳储量为63 200~66 000 kg·hm-2、氮储量为5 800~5 900 kg·hm-2。T1~T4 处理较CK1 处理碳储量显著提高49.24%~55.76%、氮储量显著提高31.54%～34.94%，较CK2 处理碳储量显著提高15.27%~20.31%、氮储量显著提高17.46%~20.49%；T1~T4处理间土壤碳氮储量无明显变化。

图2 不同施肥措施下的土壤碳储量和氮储量Fig. 2 Soil carbon storage and nitrogen storage of soil under different fertilization treatments

2.3 不同施肥处理对植烟土壤酶活性的影响

如图3 所示，较单施化肥处理，增施生物有机肥处理的收获期土壤蔗糖酶和脲酶的活性得到显著提高。土壤蔗糖酶活性为60.12~66.47 mg·d-1·q-1、脲酶活性为1.78~2.21 mg·d-1·q-1。从图3 可知，较CK1 处理，CK2 处理蔗糖酶活性提高10.56%、脲酶活性提高24.57%；T2~T4 处理蔗糖酶活性极显著提高8.45%~8.88%（P<0.01）、脲酶活性显著提高17.91%~23.03%（P<0.05），T1~T4处理蔗糖酶活性和脲酶活性分别提升8.45%~8.88%、17.91%~23.03%。T1~T4 处理间蔗糖酶和脲酶活性呈逐渐上升趋势。

图3 不同施肥措施下的土壤蔗糖酶和脲酶活性Fig. 3 Activity of soil invertase and urease under different fertilization treatments

2.4 不同施肥处理对植烟土壤微生物量的影响

不同施肥措施下，土壤微生物量碳氮变化如图4所示。与CK1相比，CK2处理下土壤微生物量碳（SMBC）提高63.47%、土壤微生物量氮（SMBN）提高42.67%，微生物熵和土壤微生物量碳氮比（SMBC/SMBN）无显著变化。T1~T4 处理SMBC 提高73.44%~81.76%，其中T1 和T2 处理SMBC 分别显著提高75.76%和81.76%（P<0.05）；T1~T4 处理SMBN提高1.47%~51.76%，其中T1 处理SMBN 显著提高51.76%（P<0.05）；T1~T3处理微生物熵提高12.19%~16.02%；T1~T4 处理SMBC/SMBN 提高15.66%~59.01%，其中T3和T4处理SMBC/SMBN分别显著提高55.94%和59.01%（P<0.05）。T1~T4处理间SMBC、SME 呈先增加后逐渐降低趋势，SMBN 逐渐下降，SMBC/SMBN呈上升趋势。

图4 不同施肥处理下的土壤微生物量Fig. 4 Soil microbial biomass analysis of soil under different fertilization treatments

2.5 不同施肥处理对烤烟农艺性状和经济性状的影响

如图5所示，不同施肥处理的烤烟生物学性状存在显著差异（P<0.05）。各处理平均有效叶片数为18.00～21.55片，平均株高为112.80~131.66 cm，平均茎围10.44~11.47 cm，平均单株叶面积2 060 ~4 240 cm2。T1~T4 处理显著提高了有效叶片数、株高、茎围和单株叶面积，烤烟促生长效果显著（P<0.05）。T1~T4 处理间烟株单株叶面积先增加后下降，烤烟茎围、节距、有效叶片数、株高无显著差异。

图5 不同施肥处理下的烤烟农艺性状Fig.5 Agronomic characters of flue-cured tobacco under different fertilization treatments

不同施肥处理的烤烟经济性状存在明显差异（图6）。各处理产量为2 120~2 760 kg·hm-2，上等烟比例为27.14%~58.79%，中上等烟比例为62.05%~86.74%。T1~T4 处理显著提高了烤烟产质量，产量提升3.92%~30.70%、上等烟比例提升16.20%~116.66%、中上等烟比例提升8.95%~39.78%。T1~T4 处理间烤烟产量、上等烟比例和中上等烟比例先增加后降低，以T3处理的烤烟经济性状最好。

图6 不同施肥处理下的烤烟产量和质量Fig.6 Yield and quality of flue-cured tobacco of soil under different fertilization treatments

2.6 不同施肥措施对烟草青枯病的防控效果

如表1 所示，不同施肥处理的青枯病病情指数和防控效果差异显著（P<0.05）。与CK1 相比，CK2 处理的病情指数显著下降37.65%，防治效果为37.64%；T1~T4 处理的病情指数显著下降70.32%~75.31%，防治效果为69.64%~75.97%；T1~T4处理间病情指数和防治效果差异不显著。

表1 烟草青枯病的发生情况Table 1 Controlling effect of different treatments on Ralstoniasolanacearum

2.7 相关性分析

由表2 可知，病情指数与pH 呈极显著正相关（P<0.01），与土壤C/N、有机碳、碳储量、氮储量、蔗糖酶、脲酶、微生物量碳和微生物量碳氮比呈极显著负相关（P<0.01），与土壤容重、碱解氮、有效磷和速效钾呈正相关关系，与微生物量氮呈负相关关系。

表2 病情指数与土壤理化性质、碳氮储量、酶活、微生物量的相关性分析Table 2 Correlation analysis between disease index and soil physical and chemical properties， carbon and nitrogen storage，enzyme activity， and microbial biomass

3 讨论

土壤容重和pH是土壤物理性质的重要指标，土壤有机碳是土壤养分转化的核心，反映土壤疏松程度和耕地质量好坏[18-20]。本研究中，减氮配施生物有机肥显著降低了土壤容重和pH，显著提高土壤C/N、有机碳含量，与胡玮等[21]研究结果相似。T1~T4 处理随氮素施用量减少，碱解氮、有效磷和速效钾含量表现为T1>T2>T4>T3，速效养分先减后增，可能是等磷、等钾条件下氮肥施用量减少，导致土壤中速效养分含量降低，这与张永亮等[22]研究结果相似。土壤碳、氮对调节土壤生产力和维持土壤养分稳定性起重要作用[23]。本研究中，增施生物有机肥后土壤碳氮储量较CK1、CK2 处理显著增加，原因可能是生物有机肥中含有大量易被微生物分解和利用的营养，外源性养分输入会导致土壤环境及作物养分转化发生改变[24]，从而影响土壤碳氮储量的变化，同时生物有机肥中含有大量的功能微生物，而土壤微生物对栖境微环境十分敏感，环境改变易引起微生物的变化，而土壤微生物又反作用于土壤环境，调控生态系统物质循环和能量流动[25]。

土壤酶在土壤养分的转化和运输过程中具有重要作用，能有效反映作物对养分的吸收利用情况，是评价土壤肥力的重要生物活性指标[26‑27]。武杞蔓等[28]研究发现，施用生物有机肥后可显著提高土壤脲酶和蔗糖酶的生物活性进而提升土壤肥力，本研究的结论与之相一致。由于配施生物有机肥加快了烟草根际土壤中有机化合物的分解，提供了酶促反应充足的底物，从而促进了微生物的分解[29]。增施生物有机肥处理以T3 处理的土壤蔗糖酶和脲酶活性最高，表明该施肥模式下土壤肥力提升效果较明显。

土壤微生物量可促进土壤养分转化，对土壤碳氮等元素的循环利用起主要作用，是评价土壤肥力的重要依据[30]。施肥是影响土壤微生物量碳氮的主要因素之一[31]，本研究发现增施生物有机肥后土壤微生物量均有不同程度提高，可能是添加生物有机肥后促进了土壤微生物的生长繁殖[32]。但减氮配施生物有机肥处理中随着化肥用量的减少，微生物量碳氮并未一直呈上升趋势，说明化肥用量并非越少越好。研究表明，土壤细菌、真菌的SMBC/SMBN 分别为3~6 和7~12[33]。本研究CK1 和CK2 处理SMBC/SMBN 均值分别为3.35、3.81，T1~T4 处理SMBC/SMBN 为3.87~5.32，说明增施农家肥和生物有机肥提高了土壤中细菌数量。而T1~T4 处理随着化肥用量的减少，SMBC/SMBN也逐渐增大，可能是土壤中有机氮比例增加促进细菌生长的同时也促进了真菌的生长，但土壤中微生物仍以细菌型为主。

作物产量、质量的降低及土壤肥力的退化是由于土壤中养分缺失导致的，因而科学合理的施肥方式能提高土壤中养分的循环利用[34]。研究表明，生物有机肥中含有大量的微生物，增加作物根际土壤中有益菌生物量的同时，还能提升土壤养分含量，从而达到促进作物生长，提高作物产量和品质的效果[35‑36]。石磊等[37]研究发现化肥减量10%配施600 kg·hm-2生物菌肥对色素辣椒生长的综合效益最佳。本研究中，生物有机肥配施化肥模式下显著提高了烟草植株农艺性状、产量和品质（P<0.05），其中，产量提升率达3.92%~30.70%，上等烟比例提升率达16.20%~116.66%；T3处理提升效果最显著且显著高于其他处理，表明增施生物有机肥减氮15%施肥模式能更好地促进烟草生长，提高产量和质量，这与周进[38]、杨志刚等[39]发现生物菌肥配施化肥可提高辣椒生长性能、光合特性、产量和品质的研究结果相似。

目前，烟草根茎类病害已成为制约烟草产业绿色可持续发展的主要限制性因子。因而，发掘并利用新型环保的生物肥料是防治烟草根茎类病害最有效的技术方法。生物有机肥中含有大量的有益微生物，施入生物有机肥后，大量有益微生物聚集在作物根系周围迅速生长繁殖，抑制病原菌的生长，形成优势菌群，分泌次级代谢产物抑制病原菌的生长繁殖，提高植物体的抗逆性能[40]。本研究中减氮配施生物有机肥明显提高了烟草青枯病的防治效果，这与陈巧玲等[41]认为施用生物有机肥显著降低了烤烟抗病品种和感病品种青枯病的发病率的研究结果一致。生物有机肥有效抑制了烟草青枯病的发生，整体上提高了烟叶的经济性状。此外，有研究表明生物有机肥可通过激活作物体内的防御酶活来提高作物的抗逆性，如过氧化物酶、儿茶酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，过氧化物酶能减缓不同作物间的相互排斥或抑制作用，苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷类次级代谢途径的限速酶和关键酶[36]。为探索此类防御酶对烟草青枯病的防病机制，后续可进一步开展验证研究。相关性结果表明，病情指数与土壤C/N、有机碳、pH、碳储量、氮储量、蔗糖酶、脲酶、微生物量碳和微生物量碳氮比呈极显著负相关，可能是生物有机肥能通过改善植烟土壤质量和环境提高烤烟抗病能力，并降低土壤有害微生物数量。