Cre/loxP系统应用于毕赤酵母基因敲除的研究进展

王未鲜　韩铭海

摘要 毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一，蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代，高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段，其中由Cre/loxP系统介导的基因改造技术受到了科研人员的广泛关注。综述了Cre/loxP系统的基本原理、应用于毕赤酵母基因敲除的技术路线及其关键的技术问题。

关键词 毕赤酵母；Cre/loxP；基因敲除

中图分类号 Q 78文献标识码 A文章编号 0517-6611（2023）15-0010-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.003

Research Progress on Gene Knockout in Pichia pastoris Mediated by Cre/loxP System

WANG Wei-xian1， HAN Ming-hai2

（1. Analytical and Testing Center， Guizhou Institute of Technology， Guiyang， Guizhou 550000；2.College of Food and Pharmaceutical Engineering， Guizhou Institute of Technology， Guiyang， Guizhou 550000）

Abstract Pichia pastoris is one of the most commonly used systems for expressing recombinant proteins， and the strategy for high-level protein expression is one of the most important research topics in this field. In the post-genomic era， efficient and convenient genetic modification is an effective means to improve the ability of protein expression in Pichia pastoris. Among them， the gene modification technology mediated by Cre/loxP system has attracted extensive attention of researchers. In this paper， the basic principle of Cre/loxP system， the technical route and the key technical issues of gene knockout in Pichia pastoris are summarized.

Key words Pichia pastoris;Cre/loxP;Gene knockout

毕赤酵母（Pichia pastoris，最新系统命名为Komagataella phaffii）是重组蛋白最常用的表达系统之一［1-2］。相比较于其他表达系统，毕赤酵母具有明显的优势：低廉的培养成本、较高的培养密度、易于操控的启动子、易于基因改造操作、优良的蛋白分泌能力、不分泌热原物质、具有真核细胞的翻译后修饰，尤其是由其表达的多肽都具有蛋白活性［1-2］。然而由此宿主表达的一些有价值的蛋白产品水平仍然较低，因此，促进异源蛋白表达的技术和策略依然是该领域最重要的研究课题之一［3-4］。毕赤酵母的基因组测序已完成，并已公开发布［5-6］，在后基因组研究中，以提高毕赤酵母蛋白表达能力为目的的高效而操作便捷的基因改造技术受到科研人员广泛关注。其中，多篇文献报道了科研人员利用Cre/loxP系统成功地完成了毕赤酵母的基因敲除操作［7-12］，充分显示了该系统应用于这种酵母基因改造的可靠性。

1 Cre/loxP系统

来自P1噬菌的Cre/loxP系统由Cre重组酶和loxP位点组成，而Cre/loxP介导的基因重组可应用于酵母、拟南芥、棉花、水稻、果蝇、小鼠和斑马鱼等多种真核细胞的基因改造［13-14］。截至2023年2月，以“Cre recombinase”为关键词，通过PubMed搜索引擎可检索到超过7 000篇的文献，这也说明了Cre/loxP系统应用于细胞基因改造技术的广泛性和有效性。

1.1 Cre重组酶

Cre重组酶是由343个氨基酸组成的单体蛋白，分子量约为38 kDa［13-14］，其有2个结构域：NTD（N-末端结构域，由110个氨基酸残基组成）和CTD（C-末端结构域，由210个氨基酸残基组成）。Cre重组酶蛋白的活性中心位于CTD结构域中，主要由Arg173-His289-Arg292三联体结构、2个亲核性氨基酸残基Trp315、Try324以及Glu176、Lys201构成，其中Try324残基具有切割活性，另外Arg259的功能与Cre重组酶的催化活性和loxP位點特异性有关［15］。Cre重组酶催化2个loxP位点之间的重组反应，不需要任何宿主辅因子或辅助蛋白［13-14］。

1.2 loxP位点

loxP位点是1个长度为34 bp的序列，由2个13 bp的反向重复序列和中间8 bp间隔序列组成，由于8 bp间隔序列是不对称的，这确定了loxP位点的方向［16-17］。在DNA分子链上，如果2个loxP位点方向相反，则在Cre重组酶的作用下，2个loxP位点之间的DNA序列发生倒位，这种情况一般不具有基因改造应用价值；如果2个loxP位点方向相同，则Cre重组酶可以高效地删除它们之间的DNA序列，产生一个新的loxP位点［13-14］。但是，新的loxP位点依然被Cre识别，并参与Cre/loxP介导的重组反应，这不利于细胞的基因改造。为了解决这一问题，研究人员使用了2种突变的loxP位点，即lox71和lox66［13-14］，它们在左臂反向重复序列或右臂反向重复序列中含有5 bp的突变（表1），lox71和lox66位点可以被Cre蛋白有效识别，重组反应产生一个新的loxP位点——lox72。lox72是一个惰性的位点，其左臂反向重复序列和右臂反向重复序列中同时含有5 bp的突变，与Cre重组酶的亲和力极微弱，因此不参与Cre/loxP介导的重组反应，从而实现lox71和lox66之间的DNA片段永久删除［13-14，18］。

2 Cre/loxP系统应用于毕赤酵母基因敲除

2.1 基本原件和主要过程

利用Cre/loxP系统敲除基因的主要核心问题是如何构建基因敲除盒（gene disruption cassette）。基因敲除盒主要包含3个基本原件［13-14］：①筛选标记基因，一般常用的是抗生素Zeocin抗性标记［7-9，11-12］，有些是G418抗性标记［10］；②位于筛选标记基因上下游的2个突变的loxP位点（一般是lox71和lox66）；③靶基因上游和下游同源臂序列。利用Cre/loxP系统敲除靶基因的过程主要分为两步［13-14］：①靶基因与基因敲除盒中的同源臂发生同源重组，基因敲除盒插入靶基因序列，破坏靶基因；②Cre重组酶催化lox71和lox66位点发生重组，删除这2个loxP位点之间的DNA序列，切除筛选标记，靶基因序列中留下1个惰性的loxP位点（即lox72），完成靶基因的敲除。

2.2 技术路线和策略

Pan等［7］报道了一种新颖的构建基因敲除盒技术路线：①将Cre蛋白基因克隆到pPICZA质粒上，通过PCR获得Cre-ZeoR序列（ZeoR是Zeocin抗性基因Sh ble的序列）；②通过融合PCR技术融合3段DNA序列，将lox71和lox66插入Cre-ZeoR序列两端，构建基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D（U为靶基因上游同源臂，D为靶基因下游同源臂）；③将基因敲除盒电转毕赤酵母，插入靶基因序列中；④甲醇诱导Cre蛋白表达，激活Cre/loxP系统删除lox71与lox66之间的DNA序列。这种方法的优点是可以采用较少的步骤来完成基因敲除盒的构建，但是同时也存在不足：①融合PCR技术对科研人员的操作经验有一定的要求，并且由于引物中存在lox66和lox71序列，其含有较多的重复序列，进一步增加了融合PCR的难度，这可能要通过多次的尝试甚至要更换不同的引物才能够获得成功；②构建的基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D无法克隆到质粒中进行保存和扩增，因此如果要敲除多个基因，则需要构建多个不同的基因敲除盒序列，这将是一项繁重的实验操作。另外Pan等［7］还推测，多次PCR可能导致基因敲除盒序列发生一定突变，可能会影响Cre/loxP系统的效率。

Han等［8］报道了一种改进的两步法策略（图1），将Cre蛋白基因和loxP序列安置在不同的质粒中，构建的中间序列可以插入质粒中保存和扩增，具体技术路线如下：①从pPICZαA获得ZeoR序列，通过PCR构建lox71-ZeoR-lox66序列原件，并插入克隆质粒中保存；②在获得lox71-ZeoR-lox66序列基础上，克隆靶基因上下游同源臂序列，构建U-lox71-ZeoR-lox66-D基因敲除盒序列；③通过电转将基因敲除盒导入毕赤酵母，嵌入靶基因；④将Cre蛋白基因克隆到pPICZαA质粒中，构建pPICZαA/Cre质粒，并将HIS4基因（源于pAO815质粒）插入pPICZαA/Cre获得辅助质粒pPICZαA/Cre/his4；⑤通过电转，将辅助质粒转化到上述已嵌入基因敲除盒的毕赤酵母中，产生U-lox71-ZeoR-pPICZαA/Cre/his4-lox66-D序列（重组位点在ZeoR序列中）；⑥甲醇诱导Cre蛋白表达，删除ZeoR-pPICZαA/Cre/his4序列。两步法技术路线的优点是：①易于操作，可以避免有技术难度的融合PCR操作；②lox71-ZeoR-lox66或U-lox71-ZeoR-lox66-D中间序列都可以克隆并保存在质粒中，有利于多基因敲除操作；③该方法中构建的辅助质粒pPICZαA/Cre/his4还可以直接应用于其他不同基因的敲除。总之，相比Pan等［7］报道的方法，虽然增加了操作步骤（增加了一次毕赤酵母的转化操作），但是對于初次接触分子生物学的研究人员是十分友好的，而且特别适用于多基因敲除的操作。

如果需要敲除的靶基因是毕赤酵母维持正常生长所必需的，那么用传统的基因敲除方法可能就得不到所需的突变菌株。对于这个技术难题，Shibui等［9］提出了一种有效的解决方案：在基因敲除盒U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D序列中插入靶基因对应的救援基因（rescue gene），当基因敲除盒序列破坏靶基因后，基因敲除盒序列中的救援基因就会弥补靶基因的功能，使毕赤酵母细胞的生长表型不会发生改变。

2.3 Cre/loxP系统在毕赤酵母中应用的技术问题

2.3.1 PAOX1驱动Cre蛋白表达。

启动子PAOX1具有较高的转录活性［1-2］，是毕赤酵母中最常用异源蛋白表达的启动子之一。大部分的文献报道，应用于毕赤酵母的Cre/loxP系统的Cre蛋白都是利用PAOX1来表达的，这也使得该系统在这种细胞中表现出了较高的活性。Shibui等［9］报道，在30 ℃，甲醇诱导PAOX1表达Cre蛋白6 h后，96%的毕赤酵母细胞完成了Cre/loxP系统介导的重组；Han等［8］报道，在28 ℃，甲醇诱导48 h，100%的毕赤酵母细胞完成了此重组反应。另外，即使lox71与lox66之间有冗长的序列，Cre蛋白依然能高效地完成催化重组。例如，Han等［8］报道，当lox71与lox66之间序列长达10 kbp时，经过48 h的甲醇诱导，基因重组效率依然达到了100%。

在毕赤酵母中，PAOX1是受到严格调控的，在有葡萄糖、乙醇、甘油等碳源存在条件下，PAOX1的转录活性是受到强烈抑制的［1-2］；但Shibui等［9］报道，在PAOX1活性被抑制的情况下，毕赤酵母中的Cre/loxP系统还是表现出了微弱活性。

在大肠杆菌中，PAOX1没有受到细胞的调控，可能表现出一定的活性，由PAOX1驱动的Cre蛋白基因出现了一定程度的渗漏表达（leakage expression）［19-20］，这就导致Cre/loxP系统表现出了一定的活性。因而，含有lox71-PAOX1-Cre-lox66序列的质粒在大肠杆菌中不稳定［8，19-20］，这也许是部分研究者选择通过融合PCR构建基因敲除盒的主要原因。

2.3.2 Cre蛋白的毒性。

目前，未发现有文献报道Cre蛋白对毕赤酵母细胞的影响，但是在其他细胞中，Cre蛋白的毒害作用已被证实。例如，Cre蛋白基因的表达可以减少哺乳动物细胞增殖、导致异常DNA重组及染色体缺陷［21］；在包括神经元细胞、心肌细胞和肿瘤细胞中也发现了Cre蛋白表达导致的毒性［21-24］；Cre蛋白表达也可以导致肿瘤细胞的消退［21］。

在哺乳动物基因组中发现了许多隐性（pseudo）loxP位点［25-26］，生物信息学分析表明某些基因组区域，这种隐性loxP位点出现的频率为1.2个/Mbp［27］。考虑到毕赤酵母的基因组大约为9.7 Mbp，因而不能忽略Cre蛋白的毒性，不能排除长期高水平表达Cre蛋白对毕赤酵母的毒性，因而使用诱导型Cre/loxP系统和及时删除Cre蛋白基因都是必须的。目前，研究者大多采用的基因敲除盒都是在U-lox71-Cre-ZeoR-lox66-D序列基础上改进的，Cre/loxP系统介导的重组反应与Cre蛋白基因的删除是同时发生的，这种策略可以避免或是降低Cre蛋白对毕赤酵母毒害的可能性。

2.3.3 同源臂的长度。

在毕赤酵母中，基因取代（gene replacement）效率高度依赖于靶基因同源臂的长度［28］，延长同源臂的长度可以有效地提高基因取代效率，提高基因敲除效率（打靶效率）。为了达到合理的打靶效率，与酿酒酵母相比，毕赤酵母中靶基因同源臂要长得多［9］。Shibui等［9］报道，当前后同源臂的长度均为40 bp时，敲除och1、URA3和ADE2的打靶效率分别为1/40（2.5%）、1/60（1.7%）和1/70（1.4%）；Han等［8］报道，当前后同源臂的长度分别为2 300和1 500 bp时，敲除cne1和his4基因的打靶效率分别为15.6%和26.7%［8］；Cregg等［28］报道，当前后同源臂的长度超过2 000 bp时，基因打靶效率能超过50%，如果同源臂的长度小于500 bp，那么其打靶效率可能会小于0.1%；Chen等［29］报道，敲除och1基因的同源臂长度分别为874和852 bp时，其基因敲除效率为1/10（10%）。除了同源臂的长度以外，影响打靶效率的因素还包括同源臂位于靶基因的位置及靶基因本身等［9，28，30］。

3 与其他基因敲除系统的比较

3.1 FLP/FRT系统

来源于酿酒酵母的FLP/FRT系统由FLP重组酶及相应的FRT位点组成，其工作机制与Cre/loxP系统极为相似：FLP重组酶催化2个同向的FRT位点发生重组，删除这2个位点之间的DNA序列［31］。FLP/FRT系统也被广泛应用到多种细胞的基因敲除技术中，其中包括毕赤酵母。例如，Cregg等［32］报道了1种利用FLP/FRT系统两步法敲除毕赤酵母（Arg-）菌株中的his4基因：①将靶基因（his4）的上下游同源臂、2个FRT位点、arg4基因序列和FLP基因构建到1个质粒上；②质粒线性化后转化到毕赤酵母中；③his4基因被基因敲除盒序列取代，而FLP介导的重组则切除arg4基因。试验结果表明，基因敲除打靶效率为26%（表型是His-的克隆比例）。另外，Ahmad等［33］报道了利用FLP/FRT系统一步法策略，其巧妙地使用了一种可自我切除的基因敲除盒，基因敲除盒序列由PAOX1、FLP基因、FRT、Sh ble基因、靶基因的上下游同源臂等组成（U-FRT-PAOX1-FLP-Sh ble-FRT-D）；该基因敲除盒序列的构建与Han等［8］报道的策略相似，通过融合PCR技术预制FRT-PAOX1-FLP-Sh ble-FRT片段，并插入质粒；再用靶基因的上下游同源臂替换FRT位点侧翼的序列，就得到了基因敲除盒序列。

3.2 CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas系统广泛存在于细菌与古细菌中，具有抵抗噬菌体和质粒DNA入侵的功能［34-35］。近年来，高效的CRISPR/Cas9系统应用于基因组编辑已经成为生物学研究的热门话题。CRISPR/Cas9系统由CRISPR序列和Cas9蛋白组成，在Cas9蛋白作用下，便可完成精准而高效的基因编辑［34-35］。CRISPR 序列包含1个前导序列（leader）、多个高度保守的重复序列（repeat）和多段间隔序列（spacer），其中Leader是启动子序列，位于CRISPR的上游，Repeat序列是长度在21～48 bp的反向重复序列，能形成发卡结构，Spacer序列则是外源DNA序列［34-35］。

CRISPR/Cas9系统广泛应用于多种细胞（包括毕赤酵母）基因敲除操作，并表现出较高的效率，受到研究者的青睐［36-39］。尽管应用Cre/loxP系统介导基因敲除的打靶效率并没有CRISPR/Cas9系统那么出色，但Cre/loxP系统的使用历史更悠久，有成熟的操作性可以借鉴，其仍然是当今酵母基因敲除常用的系统［36-39］，另外，一些研究者也在使用过程中不断改进Cre/loxP系统的技术和策略，也确实进一步提升了其应用价值［7-12，40］。在采用合理的上下游同源臂长度的条件下，Cre/loxP系统介导的基因敲除技术能表现出良好的打靶效率，是完全能够满足毕赤酵母常规的基因敲除操作；如果能采用精简的基因敲除盒序列，预制中间序列（例如lox71-Sh ble-lox66），则可大大便捷基因敲除盒的构建，特别有利于多个基因敲除的操作。

4 结语

Cre/loxP系统已被证明能有效地应用于毕赤酵母基因敲除技术，至今仍具有良好的应用价值。在利用Cre/loxP系统时，①要注意Cre蛋白渗漏的问题，这将导致含有lox71-Cre-lox66序列质粒在大肠杆菌中不稳定；②要保证靶基因上下游同源臂的长度以满足合理的打靶效率；③建议利用强启动子来表达Cre基因，例如PAOX1，以确保Cre/loxP系统表现出良好的活性；④建議预制基因敲除盒的部分序列，以方便基因敲除盒序列的构建，以提高多个基因敲除操作的效率。

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基金項目 国家自然科学基金项目（32260012）；贵州省科学技术基金资助项目（黔科合基础〔2020〕1Y148号）。

作者简介 王未鲜（1976—），女，山西原平人，实验师，硕士，从事微生物蛋白工程的研究。*通信作者，副教授，博士，从事毕赤酵母高效蛋白表达技术研究。

收稿日期 2023-02-24