经皮穴位电刺激对结直肠癌大鼠免疫功能的改善作用及其机制

张秉丽 霍成英 李有连 朱海宏

(青海仁济医院消化内科,青海省西宁市 810021)

结直肠癌是消化系统恶性肿瘤之一,其发生与吸烟、饮酒等因素有关,发病率和病死率的增高使其成为当前广受关注的健康问题之一[1]。经皮穴位电刺激(transcutaneous electrical acupoint stimulation,TEAS)是基于中医针灸理论,通过放置于皮肤表面的电极将电脉冲发送到穴位的一种临床治疗技术。目前,TEAS在肠腔镜后镇痛、减少手术后认知功能障碍的发生、调节免疫和内分泌功能等方面效果显著,且因具有无创、操作简单等优点而备受临床医生的青睐[2-3],但其作用机制尚未完全明确。有研究表明,在行全身麻醉腹腔镜结直肠癌根治术前给予TEAS治疗,可减轻患者机体的炎症反应和免疫抑制,以及麻醉对机体认知功能的损害[4]。因此,本研究分析TEAS治疗对结直肠癌大鼠免疫功能的影响。CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞可直观反映人体免疫功能,其中CD4+T淋巴细胞可响应先天性免疫应答产生的细胞因子信号,CD8+T淋巴细胞不仅可以抵抗细胞内的病原体,还可以在肿瘤保护性免疫中发挥调控作用[5]。故本研究选择这两个指标来评估结直肠癌大鼠的免疫功能。

核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是结直肠癌细胞增殖、血管生成、转移、凋亡和耐药性产生的关键调节因子,其是由5种Rel蛋白[RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB (p50)、NF-κB2(p52)]两两结合构成的同源或异源二聚体, 而p65/p50为最常见且功能明显的异源二聚体,其中p65表达下调可抑制肿瘤的进展[6]。因此,本研究通过检测NF-κB mRNA和NF-κB(p65)蛋白的表达量来探讨TEAS对结直肠癌大鼠免疫功能改善作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取无特定病原体级健康SD雄性大鼠40只,7～8周龄,体重为180～220 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[动物许可证号:维通利华SCXK(京)2016-0006]。动物喂养及实验操作均遵循“3R”原则。

1.2 主要仪器与试剂 韩氏穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司,LH-202H型);流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,Accuri® C6 Plus型);超微量紫外分光光度计(DeNovix公司,DS11型);荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司,CFX96型);大小鼠专用软性肠道内窥镜(上海亭芬生物科技有限公司,MiniScope 2V型)。1,2-二甲基肼(1,2-dimethylhydrazine,DMH)购于北京索莱宝科技有限公司;miRcute miRNA提取分离试剂盒(DP501)、miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(KR211)、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Green)(FD411)、DNA/RNA/蛋白质共提取试剂盒和二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司;NF-κB(p65)兔多抗(批号:ab16502)、β-actin(批号:ab8227)、抗兔抗山羊二抗(批号:B205718)均购于Abcam公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组、模型的建立及干预:所有大鼠按照无特定病原体级的要求喂养7 d后用于实验。将40只大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、经皮非穴位刺激组、TEAS组,每组10只。除空白对照组外,另外3组均建立结直肠癌模型,即于大鼠颈背部皮下注射30 mg/kg的DMH,1次/周,共注射18周。建模成功的标准为实验结束时处死大鼠观察其结直肠内部有肿瘤形成[7]。其间,所有大鼠均常规饲养,自由饮水。第19周起开始进行干预。其中,于经皮非穴位刺激组大鼠双侧下肢非穴位处给予电刺激,刺激方案为连续波、强度5 mA、频率2 Hz,持续30 min,1次/d,连续刺激7 d;于TEAS组大鼠双侧足三里穴位点处(膝关节下方,腓骨小头下0.5 cm处的肌沟中)给予电刺激,刺激方案同经皮非穴位刺激组。其余两组均无任何处理。

1.3.2 一般情况观察:实验期间每天观察各组大鼠的状态并测量体重。

1.3.3 CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞含量的测定:在实验结束后,经尾静脉取血1 mL。使用流式细胞仪测定CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的含量,并计算CD4+/ CD8+值。

1.3.4 血清NF-κB mRNA表达水平的检测:在实验结束后,经尾静脉取血1 mL。分离血清后提取总RNA,然后将RNA反转录为单链cDNA,均严格按照试剂盒说明书进行操作。采用实时荧光定量PCR检测NF-κB mRNA的相对表达水平,以β-actin作为内参基因。NF-κB引物上游序列为GCTTTGCAAACCTGGGAATA,下游序列为TCAGGTCCATCTCCTTGGTC;内参β-actin引物上游序列为GTGACGTTGACATCCGTAAAGA,下游序列为GCCGGACTCATCGTACTCC。实时荧光定量PCR的反应体系为10 μL的2×Premix、1.6 μL的50×ROX参比染料、0.5 μL的10 μmol/L上游引物、0.5 μL的10 μmol/L下游引物、1.5 μL的cDNA、5.9 μL的ddH2O,共20 μL。反应条件为 94 ℃预变性2 min,94 ℃变性20 s、 60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s (共40个循环)。采用2-ΔΔCt法计算NF-κB mRNA的相对表达水平,其中ΔΔCt=实验组(Ct目的基因-Ct内参基因)-对照组(Ct目的基因-Ct内参基因)。

1.3.5 癌组织NF-κB(p65)蛋白表达水平的检测:实验结束后,采用脊椎脱臼法处死大鼠并进行解剖,使用大小鼠专用软性肠道内窥镜观察结直肠癌变位置,取距癌变5 cm处组织和癌组织,取空白对照组大鼠相应部位组织。先提取组织总蛋白,再使用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。经上样、电泳、转膜后,使用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h。加入一抗(稀释比例为1 ∶1 000)过夜封闭,采用TBST液洗膜3次,10 min/次。使用二抗(稀释比例为1 ∶2 000)封闭2 h,采用TBST液洗膜3次,10 min/次。显影、曝光后,采用LabWorks 4.5分析系统软件对条带进行半定量分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以(x±s)表示,多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组大鼠的一般情况 实验期间,空白对照组大鼠的活动、饮水、摄食均正常,毛发有光泽,无异常;其他3组大鼠在建模后精神状态萎靡,饮水、摄食和活动减少,背部毛发蓬松且失去光泽,尿黄。实验末期,TEAS组大鼠饮水、摄食恢复正常,活动量增加。实验结束后处死所有大鼠,在建模的大鼠中均观察到结直肠内有肿瘤形成,提示建模成功。实验前,4组大鼠的体重差异无统计学意义(P>0.05);实验结束后,空白对照组、TEAS组、经皮非穴位刺激组、模型组大鼠体重依次降低(均P<0.05)。见表1。

表1 实验前后4组大鼠体重的比较(x±s,g)

2.2 4组大鼠T淋巴细胞亚群含量的比较 实验结束后,模型组和经皮非穴位刺激组的CD8+T淋巴细胞含量均高于空白对照组和TEAS组(均P<0.05);与空白对照组比,另外3组的CD4+/CD8+值均降低,且TEAS组的CD4+/CD8+值均高于模型组和经皮非穴位刺激组(均P<0.05);4组大鼠的CD4+T淋巴细胞含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组大鼠T淋巴细胞亚群含量的比较(x±s)

2.3 4组大鼠NF-κB mRNA和NF-κB(p65)蛋白表达水平的比较 实验结束后,模型组和经皮非穴位刺激组NF-κB mRNA、NF-κB(p65)蛋白的表达水平均高于空白对照组和TEAS组(均P<0.05),而TEAS组与空白对照组之间上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 4组大鼠NF-κB mRNA和NF-κB(p65)蛋白的相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

结直肠癌是临床常见的恶性肿瘤,其发病机制尚未完全明确,具有较高的发病率和病死率,且结肠癌切除术后的复发和术后化疗药物的耐药性可对结直肠癌患者的生命造成巨大威胁[8]。TEAS通过刺激足三里穴提高机体免疫力,增加机体防御疾病的能力,并对消化系统、循环系统、呼吸系统和神经系统具有调节作用[9]。故本研究使用TEAS干预结直肠癌大鼠,分析其对大鼠免疫功能的改善作用及其可能机制。结果显示,模型组、经皮非穴位刺激组、TEAS组大鼠在建模后出现精神状态萎靡,饮水、摄食和活动减少,背部毛发蓬松且失去光泽,尿黄;但实验末期,TEAS组大鼠饮水、摄食恢复正常,活动量增加。这提示TEAS能够使结直肠癌大鼠的一般情况恢复正常。在结直肠癌免疫微环境中,T淋巴细胞亚群可直观反映机体的免疫功能,其中CD4+T淋巴细胞是辅助性T淋巴细胞,CD8+T淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞,CD4+/CD8+值降低提示机体免疫功能下降[10]。本研究中,实验结束后,空白对照组和TEAS组的CD8+T淋巴细胞含量均低于模型组和经皮非穴位刺激组(均P<0.05);与空白对照组比,另外3组CD4+/CD8+值均降低,但TEAS组的CD4+/CD8+值均高于模型组和经皮非穴位刺激组(均P<0.05)。这提示结直肠癌大鼠的免疫调节功能明显下降,但经TEAS治疗的结直肠癌大鼠免疫功能明显恢复。有研究表明,TEAS具有调节直肠癌手术患者免疫功能、促进患者肠功能恢复的作用[11-12],这与本研究结果相似。上述研究结果为将TEAS用于调节结直肠癌患者的免疫功能提供了依据。

NF-κB信号通路是炎症反应的关键调节通路,对调控肿瘤细胞增殖和凋亡、氧化应激反应、炎症反应具有至关重要的作用[13]。方兴保等[14]和陈景志等[15]也报告,结直肠癌的发生与NF-κB信号通路的活化有关。本研究结果显示,实验结束后,模型组和经皮非穴位刺激组NF-κB mRNA、NF-κB(p65)蛋白的表达水平均高于空白对照组,而TEAS组NF-κB mRNA、NF-κB(p65)蛋白的表达水平均低于模型组和经皮非穴位刺激组(均P<0.05)。这提示结直肠癌组织中NF-κB的表达上调,TEAS治疗能下调NF-κB的表达,表明NF-κB信号通路可能是TEAS改善结直肠癌大鼠免疫功能的关键通路。

综上所述,TEAS可改善结直肠癌大鼠的免疫功能,其可能通过调节NF-κB信号通路来发挥作用。