蓖麻毒素A 链（RTA）和RTA-4D5 scFv 的穿膜改造探究

许嘉文

（华东理工大学鲁华生物技术研究所，上海 200237）

1 文献综述

许多植物都可以产生被称为核糖体蛋白失活蛋白（RIPs）的蛋白毒素，RIPs 的主要功能是作为保护免受微生物入侵的工具[1]。蓖麻毒素是二型核糖体蛋白失活蛋白的一种，由二硫键连接的A 链和B 链组成。蓖麻毒素被细胞内吞后，绝大多数内化的蓖麻毒素被转运回细胞表面，剩余部分被运送到溶酶体并被降解，最终只有很小一部分被运输到高尔基体网络[2]。而蓖麻毒素A链需要穿过细胞膜，通过逆向转运途径进入胞浆中才能发挥毒性用，导致细胞凋亡。因此蛋白毒素在胞内的定位是展现其细胞毒性的关键[3]。研究人员在蛋白质末端添加短肽改善其穿膜或定位能力，这种短肽被称为信号肽。

KDEL 是一种最常见的内质网定位肽，由四个氨基酸残基组成，通常存在于哺乳动物和植物细胞中，一般只有在蛋白质的C 端才能发挥蛋白质的内质网定位作用。而DEKKMP 是 E3/19K 蛋白的C 端末尾的6 位残基，同样也是一种内质网保留信号。如今更多的新型穿膜肽正在被发现，其中一种很有潜力的穿模肽来自乙型肝炎病毒（HBV）编码的X 蛋白。Xentry 由X 蛋白中的7 个氨基酸残基组成，序列为LCLRPVG，该短肽能够渗透多种癌细胞系，包括HepG2、H441、BT474[4]。由于许多不同的细胞类型表达多配体蛋白聚糖，特别是高水平表达多配体蛋白聚糖的上皮细胞，Xentry 可用于将药物递送至疾病治疗中的组织。[5]

蓖麻毒素作为抗肿瘤药物，已被研究人员广泛而深入地研究，其抗肿瘤作用已在许多实验模型中得到证实，如人肿瘤细胞移植到裸鼠体内的实验[6]，但是蓖麻毒素自身对肿瘤细胞并没有特异性，使用蓖麻毒素同样会杀伤正常细胞。为了解决蓖麻毒素对肿瘤细胞的特异性问题，近年来蓖麻毒素和其A 链被用于合成靶向性肿瘤治疗的免疫毒素，并显示出良好的特异性抗癌活性[7]。

本实验利用内质网定位信号肽，使单链A 链蓖麻毒素在没有B 链的辅助下依旧能够高效逆向运输，细胞内化蓖麻毒素后将蓖麻毒素快速引导至内质网，从而增强细胞毒性。同时利用4D5 scFv 对特定肿瘤细胞的高特异性，减轻其对正常细胞的杀伤力。由于蓖麻毒素和4D5 连接后蛋白分子量较大，在细胞内化过程中不易被细胞摄入，所以在蛋白中插入一段穿膜肽以辅助蛋白毒素的内化。通过以上改造，希望构建的蛋白毒素能用于临床肿瘤治疗。

2 实验方法（过程）

2.1 引物设计

使用Snapgene 软件，依据PCR 和重叠PCR 的原理设计引物。

2.2 质粒构建

2.2.1 PCR 反应

质粒pET-28a-SUMO-RTA-KDEL（质粒1）、pET-28a-SUMO-RTA-4D5-KDEL（质粒2）由实验室保存，用来作为本实验的PCR 模板；使用设计好的引物S1primer，primer2 和质粒1 进行PCR，获得SUMO-RTA-KDEL3（RK3）片段；使用设计好的引物S1primer，primer3 和质粒2进行PCR，获得SUMO-RTA-4D5-KDEL3（R4K3）片段；使用设计好的引物S1primer，primer4 和质粒2 进行PCR，获得SUMO-RTA-4D5-DEKKMP（R4D）片段；将上述PCR 反应产物进行核酸电泳验证，并使用OMEGA 公司的Cycle Pure试剂盒回收PCR 片段。

表1 引物

以质粒2 为模板，分别使用设计好的引物S1primer，primer5 和primer6，primer4 进行PCR，获得SUMO-Xentry和Xentry-RTA-4D5-DEKKMP；对PCR 产物核酸电泳，并用OMEGA 公司的Gel Extraction 试剂盒切胶回收目标片段。

以回收的PCR 产物为重叠PCR 模板，加入S1 primer，primer4，PCR获得SUMO-Xentry-RTA-4D5-DEKKMP（XR4D），进行核酸电泳验证并用OMEGA 公司的Cycle Pure 试剂盒纯化。

2.2.2 PCR 产物的连接

将上述所有PCR 产物和pET-28a 用限制性核酸内切酶Nco Ⅰ和Xho Ⅰ在37℃下水浴酶切2 小时。使用T4 连接酶将回收的PCR 酶切产物与酶切pET-28a 质粒连接，22℃，4h 或16℃过夜。

2.3 重组质粒转化和验证

将由PCR 连接的产物及DH5α 感受态细胞冰浴10 min 使其融化。再将10μL 的PCR 连接产物加入DH5α，并继续冰浴30min。后迅速以42℃金属浴热激90s，并及时放回冰浴，持续降温2min。最后加入1mL 的普通LB 培养基，于37℃孵育1h。孵育完成后，4000rpm离心90s，弃去上清，加入150μL 的普通LB 培养基重悬菌体，然后将其涂布在含有卡那抗性的LB 培养基平板上，于37℃摇床倒置，过夜培养。本实验采取菌落PCR 以及核酸电泳验证转化结果，将PCR 产物进行核酸电泳，并观察电泳结果，若电泳结果显示PCR 产物大小与目的片段大小一致，则表明重组质粒转化初步成功。将验证成功的菌液加入0.5mL 的含有卡那霉素的LB培养基中后，置于37℃摇床中培养6h 并测序。使用试剂盒将测序正确的菌液培养并抽提质粒，将质粒转化入BL21 感受态细胞中，获得重组表达菌株。

2.4 诱导蛋白表达

取1.5 mL 菌液分别加入3 个200mL 卡那抗性的LB摇瓶中，37℃摇床中培养4 小时，加入50μL 1M 的IPTG诱导，放入18℃摇床中诱导表达，诱导时间为16h～20h左右。

2.5 蛋白纯化

2.5.1 镍柱纯化

诱导表达结束后，去除上清LB 培养基，加入40mL PBS 缓冲液重悬菌体，利用超声破碎仪进行细胞破碎，并取上清倒入干净的离心管。将上清先通过0.45nm 孔径的滤膜过滤，然后将上清通过镍柱使其与镍柱结合。分别用50mM、100mM、200mM 以及500mM 浓度的咪唑溶液对镍柱洗脱，并收集洗脱液。分别将上样流穿液和各浓度咪唑洗脱液取出30μL，加入10μL4×蛋白上样缓冲液，制成蛋白样。SDS-PAGE 电泳检验目标蛋白所在洗脱区间。

2.5.2 透析、浓缩、SUMO 酶切和再纯化

用SUMO 蛋白酶对目的蛋白进行酶切，以获得单独的RK3、R4K3、R4D 和XR4D 蛋白。蛋白透析液采用20 mM 的PBS 缓冲液，将纯化的蛋白装在透析袋中用夹子夹好，然后放在PBS 缓冲液中进行透析。将蛋白通过10kDa 的超滤膜浓缩至10mL，并加入1mL 的SUMO 酶4℃过夜酶切。酶切产物通过镍柱纯化，并进行蛋白电泳检测纯化结果。

2.6 蛋白抗肿瘤活性检测

采用MTT 法检测目的蛋白对正常细胞及SKOV3 肿瘤细胞的毒性。先将80%铺板率的细胞消化，制成单个悬浮的细胞液，再用血球计数板计数10μL 的细胞液。将细胞悬浮液稀释到每1mL 含1×105 个细胞，每孔100μL 接种到96 孔板上，在37℃、5%CO2的环境下培养24h，让细胞贴壁。细胞贴壁后，去除孔板中的完全培养基，用维持培养基将蛋白稀释成不同浓度，加入孔板中培养72h。每孔加入10μL MTT 溶液，再培养4h。弃去上清液，每孔加入100μL 二甲基亚砜，在酶标仪上振荡5min，然后读取490nm 处的吸光度。然后再弃去上清，每孔加入100μL DMSO 溶液，在酶标仪上震荡5min 后，使用酶标仪测定490nm 处的吸光度。

3 实验结果与结论

由表2 的实验结果可知，RK3 蛋白对H460 细胞和SKOV3 细胞有相似的抑制率，RK3 对正常细胞和肿瘤细胞均有一定的杀伤性且对正常细胞杀伤性略大于肿瘤细胞。R4K3 蛋白对正常细胞H460 几乎没有杀伤性，但对SKOV3 肿瘤细胞具有显著的抑制能力。

表2 不同蛋白对H460 和SKOV3 的细胞抑制率

R4D 蛋白对正常细胞H460 几乎没有杀伤性，但对SKOV3肿瘤细胞具有显著的抑制能力。与R4K3蛋白相比，R4D 蛋白对细胞的抑制能力基本相同。

XR4D 蛋白对正常细胞H460 几乎没有杀伤性，但对SKOV3 肿瘤细胞具有显著的抑制能力。与R4K3 和R4D蛋白相比，R4D 蛋白对细胞的抑制能力基本相同，但达到最大抑制效果所需的蛋白浓度有所下降。

4D5 scFv 片段在提高蛋白毒素对肿瘤细胞的特异性方面有显著的功效。但同时由于4D5 scFv 片段蛋白较大，可能是导致含有该片段的蛋白毒素相较于RTAKDEL 对肿瘤细胞杀伤性有所下降的原因。带有Xentry穿膜肽的蛋白毒素由于其穿膜能力较强，所以达到最大毒性所需要的蛋白浓度相较没有穿膜肽的蛋白毒素更低。带有KDEL3 或DEKKP 内质网保留信号肽的蛋白毒素在蛋白毒性上相较于没有内质网保留信号肽的RTA蛋白更强，说明内质网保留信号肽可以增强蓖麻毒素的细胞毒性。

4 展望

蓖麻毒素A 链是免疫毒素的研究热点，本实验通过添加4D5 scFv 片段提高了RTA 蛋白对肿卵巢癌瘤细胞的特异性，通过添加内质网保留信号KDEL、KDEL3、DEKKMP 提高了其蛋白毒性，通过添加Xentry 穿膜肽降低了达到最大细胞抑制率所需的蛋白浓度。但是DEKKMP 和Xentry 的作用机理并没有进行深入探究，虽然已有文献对这两个信号肽做出机理的解释，但都并非是在RTA 蛋白毒素方面的研究。在今后的实验中，可以尝试利用流式细胞仪测量细胞凋亡的早期和晚期比例，同时用激光共聚焦法观察DEKKMP 和Xentry 影响下的RTA 蛋白在细胞中的分布，以进一步研究其作用机理。