水飞蓟素在慢性疾病中的抗氧化作用研究概述

龙涛,张慧丹,孟璐,宗艺璇,丁雅雪,丁启龙

(中国药科大学药学实验教学中心,江苏 南京 211198)

水飞蓟素是一种自水飞蓟种子中提取的类黄酮化合物的混合物,因其具有良好的抗氧化、抗炎活性成为广为人知的护肝药物[1-2]。水飞蓟素由多种成分共同构成,包括水飞蓟宾(silybin A&B)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟宁(silydianin)、水飞蓟汀(silychristin)和其他黄酮类物质等[2]。其中silybin A占总提取物的50%～70%[3-4]并发挥主要药理活性,因此silybin A常作为水飞蓟素的代表化合物进行研究(下文提及的水飞蓟素包含或代指水飞蓟宾)。水飞蓟素的低毒性使它几乎没有副作用,只有当剂量超过10 g·d-1时才可能产生不良反应[3]。水飞蓟素过去在临床上常作为慢性肝损伤的治疗药物和肝保健品使用,但随着相关研究的不断进行,水飞蓟素不再局限于肝脏疾病,研究表明水飞蓟素对其他慢性疾病同样具有治疗效果,本文总结了近年水飞蓟素通过其强大的抗氧化活性来治疗氧化应激引发的慢性疾病的药理研究。

氧化应激,指人体内原本处于动态平衡的氧化还原态,因体内外因素如年龄、致病、药物或不健康的生活方式等,引起产生过多氧化态物质——活性氧簇(reactive oxygen species ROS)将还原态物质消耗殆尽,原本的动态平衡趋向氧化态而引起的应激损伤。ROS被定义为含有氧的不稳定分子,常见的ROS种类包括单线态氧、过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH-)、超氧化物(O2-)、一氧化氮(NO)和过亚硝酸根(ONOO-)等,长期处于氧化应激态会引起机体细胞功能障碍、蛋白质和脂质过氧化、DNA损伤最终导致不可逆的细胞损伤和死亡[5]。水飞蓟素可通过发挥自身强大的抗氧化能力来治疗各类慢性疾病,因此抗氧化机制如何发挥效果是我们首先探讨的重点。

1 水飞蓟素的抗氧化作用机制

1.1 抑制ROS产生

1.1.1 抑制线粒体ROS产生 线粒体是细胞进行氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)的重要场所,同样也是产生ROS的最主要内源性来源,线粒体在呼吸氧化过程中,其产生的能量会以电化学势能储存于线粒体内膜,在内膜两侧造成质子及其他离子浓度的不对称分布而形成线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)。在收到其他因素如缺氧、自噬或是病理性损伤可导致MMP异常下降[2,6],使得呼吸链中的电子与复合体Ⅰ、Ⅲ中的氧气直接反应,形成超氧阴离子(O2-),进而产生过氧化氢(H2O2)[7]。在氧化应激受损的HepG2细胞和PC12细胞中,水飞蓟素处理后可以使造模细胞的异常下降的MMP和失活的复合体得到恢复[1],并有助于调节线粒体膜的通透性和稳定性[2]。

1.1.2 抑制ROS合成酶表达 ROS的主要来源酶有：①NADPH氧化酶(NOX),NOX引起的ROS产生受核因子Nrf2调节,核因子Nrf2是介导抗氧化保护的关键转录因子[2,8];②黄嘌呤氧化酶(XOs)：是黄嘌呤氧化还原酶的一种形式,多位于内皮细胞中,是心脏病发作相关的缺血再灌注损伤中ROS产生的重要来源;③一氧化氮合酶(iNOS)解偶联：机体受损导致NO释放不完全导致iNOS变得解偶联和结构不稳定,引起ROS的产生增加[2,5]。水飞蓟素处理可以抑制NOX2/4、XOs或通过抑制iNOS的解偶联来防止ROS过度产生,并且可以激活Nrf2和抑制NF-κB来调节信号传导抑制ROS合成酶的表达与活性[2]。

1.1.3 抑制芬顿(Fenton)反应[2]Fenton反应是指在细胞膜转铁蛋白(SLC11A3)作用下,将Fe2+转化为Fe3+,并将H2O2自发地转化为羟基自由基(OH-),导致Fe3+和ROS累积的过程[9],同样是ROS的一大来源。Fenton反应的发生会引发细胞铁死亡(ferroptosis)的发生以及重要器官中的铁离子异常蓄积进一步导致器官衰竭[10]。水飞蓟素作为良好的金属螯合剂和抗氧化剂,能有效地螯合游离Fe2+/3+、Cu2+等金属离子,减少Fenton反应的发生来发挥抗氧化作用并降低细胞铁死亡的概率。

1.2 提高机体抗氧化功能

1.2.1 增强抗氧化物酶的表达 水飞蓟素可通过增加抗氧化物酶体如谷胱甘肽过氧化物酶体(GPX)、谷胱甘肽合成限速酶(GCL)以及核因子(Nrf2)的表达,并增强抗氧化物的生成如GSH的合成以及增强超氧化物歧化酶(SOD)活性,与多余产生的ROS进行氧化还原反应[2]。

1.2.2 改善脂质过氧化,抑制脂质沉积 水飞蓟素处理可以促进脂质分解代谢和抑制脂肪生成途径而显著减少甘油三酯(TG)蓄积,上调肉碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、改变过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和胆固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)水平来减轻游离脂肪酸(FFAs)诱导的NAFLD的改善作用[11]。

1.3 清除自由基 水飞蓟素自身就具有强大的清除自由基功能,这似乎归功于其所有成分均含有4～6个酚羟基(Ph-OH),这个结构给予了水飞蓟素较强的还原性,可以直接清除体内的氧化态自由基。经过DPPH自由基清除测定,20-OH基团被确定为最活跃的自由基清除功能基团,也是负责脂质过氧化抑制活性的最重要基团[12]。

2 水飞蓟素在慢性疾病的药理学研究

慢性疾病是指一类病程长,病因隐匿而复杂,且有尚未完全被确认疾病的概括性总称。膳食不合理、身体活动不足、吸烟和过度饮用酒精是慢性疾病的四大致病因素,这些因素均能导致机体呈偏氧化应激态进而诱发多种慢性疾病的发展。水飞蓟素具备的强抗氧化性让其不再限制于护肝药的应用,越来越多的研究表明水飞蓟素在其他慢性疾病中都可以发挥良好治疗作用。包括动脉粥样硬化[13]、慢性阻塞性肺病[14]、肾脏疾病[15]、心血管疾病[2]、阿尔茨海默病等神经退行性疾病[16]和各类癌症如胰腺癌[17]、胃癌[18]等疾病都有不错的治疗效果,下面集中对这些疾病的影响机制进行归纳阐述。

2.1 抗慢性肝损伤 作为传统的护肝药物,水飞蓟素对于非酒精性脂肪肝(NAFLD)导致的肝炎、肝硬化等慢性肝病均具有良好的治疗效果：在高胆碱、高蛋氨酸持续8周喂食诱导的小鼠NAFLD模型中,水飞蓟素可与橘皮素(Tangeretin TG)联用共同调节氧化应激、炎症反应和脂质代谢以及提高生物利用度来增强水飞蓟素对NASH的治疗作用[19]。服用水飞蓟素和维生素D和维生素E复合体(Real sil 100D©)6个月对NAFLD患者体内氧化应激代谢标志物、内皮功能障碍和疾病恶化标志物的影响结果均为改善[20]。也有研究表明水飞蓟素可以逆转果糖与脂肪共同造模的NAFLD症状[21],高果糖过去被认为不会引起血糖增高,近期研究表明过度果糖摄入会刺激肝细胞脂质的从头生成过程,水飞蓟素可通过下调脂肪生成基因的主要转录因子PPARγ的表达来减少果糖/游离脂肪酸(Fru/FAAs)组合导致的大量肝细胞甘油三酯积累。类似的发现水飞蓟素调抗脂质过氧化也在Vecchione等[11]建立的在脂肪变性(SS)和NASH的体外模型中,发现水飞蓟素也可防止过多的甘油三酯积累,已经证实了其可调控转录因子PPAR和FAs线粒体、过氧化物酶体和ER氧化酶的表达变化,特别是改善了FFAs诱导的线粒体功能障碍,以及SH条件下的凋亡信号和氧化应激标志物。而在四氯化碳(CCl4)诱导的肝损伤中,Demiroren等[22]提出水飞蓟素可改善谷丙转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板源性生长因子(PDGF-BB)、白介素-6(IL-6)和总氧化状态(TOS)的水平,并显示对肝谷胱甘肽(GSH)水平、炎症和坏死的积极作用。

2.2 抗心血管疾病 氧化应激在动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病中是关键致病因素之一[23],在砷诱导的心脏毒性模型中,水飞蓟素显示出对氧化应激和心脏损伤显著的保护作用,并有助于恢复心脏组织的抗氧化状态和正常的组织学结构,这可能归功于其抗氧化和稳定细胞膜稳态作用[24]。

2.3 抗代谢综合征 许多研究揭示了水飞蓟素可作为代谢综合症的有效治疗方法,显示了其在肥胖、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病等代谢类疾病方面的有效性[25]。足细胞损伤是糖尿病肾病发病机制的主要因素,这种损伤形式至少部分是由ROS的过量产生引起的。蛋白尿是糖尿病患者进展为终末期肾病的独立临床预测指标,而肾小球足细胞丢失是糖尿病肾病发病机制中的早期事件[26]。研究表明水飞蓟素具有纠正糖尿病肾病足细胞丢失和蛋白尿的能力,在高糖诱导的足细胞氧化应激损伤中,NOX4被证明是其ROS产生的主要来源,而水飞蓟素至少部分的通过抑制NOX4活性和抑制足细胞中超氧阴离子的产生,从而实现抗氧化和抗凋亡作用[4]。在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾病中,水飞蓟素纳米脂质体治疗显著抑制炎症相关蛋白、白介素-6(IL-6)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达,调节JAK2/STAT3/SOCS1和TGF-β/Smad信号通路,从而对糖尿病肾病模型大鼠肾脏起到保护作用[26]。

2.4 抗肿瘤 癌症的致病因素多是长期以来不健康的生活习惯所致的正常细胞基因突变,是一种慢性积累到急性质变的过程,水飞蓟素的抗癌作用在诸多研究都有讨论,但其是否与抗氧化功能有关目前尚不清楚,有趣的是,在肿瘤疾病中水飞蓟素似乎并非完全通过抵抗癌细胞内的ROS发挥作用,相反是通过引发癌细胞中的氧化应激来产生治疗效果。对于前列腺癌,水飞蓟素通过激活线粒体上附着的NOX4,产生更多的ROS导致细胞内钙离子稳态遭到破坏进一步引起内质网应激来诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡[27];对于胰腺癌：水飞蓟素能显著诱导胰腺癌细胞内产生ROS,进一步激活JNK/SAPK促进SW1990人胰腺癌细胞的凋亡和促自噬信号传导[19];另外还有研究表明可用于减少化疗和放射治疗的副作用,提高各种癌症类型的抗癌效果,特别是在胃肠癌中,并且重点提出水飞蓟素这内黄酮类化合物与胃肠道吸收交叉的情况也能通过激活KEAP1/NRF2/ARE和抑制NF-κB信号通路发挥抗氧化作用而非清除自由基[28];Kim等[29]提出水飞蓟素通过抑制p-ERK和激活p-p38和p-JNK而抑制AGS胃癌细胞生长。另外在肝癌[30]研究中,水飞蓟素可以减少肝癌造模大鼠肝脏MDA的产生,增加肝脏GSH含量,并提高肝脏抗氧化酶活性,其机制是通过抑制HGF/c-Met、Wnt/β-catenin以及 PI3K/Akt/mTOR信号通路来产生的。在肺癌研究中,Wu等[31]证明水飞蓟素抑制MDSC的浸润和功能,从而通过升高Th1相关细胞因子(IFN-g、IL-2)促进抗肿瘤免疫反应,降低IL-10水平,增强CD8+细胞毒性T细胞的浸润和功能,从而抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长。

2.5 抗神经退行性疾病 机体衰老是神经退行性疾病的主要风险因素,衰老过程中ROS的积累是神经系统受损的主要原因。受 ROS 影响的靶标包括细胞核和线粒体 DNA、脂质、蛋白质、钙稳态、线粒体动力学和功能、细胞结构、受体运输和内吞作用以及能量稳态。通过引起神经细胞毒性、诱发多巴胺纹状体功能丧失以及淀粉样蛋白β(Aβ)和过度磷酸化Tau蛋白的产生和积累,最终导致神经退行性疾病的发展[32]。水飞蓟素可以通过干预氧化还原态来发挥抗神经退行性疾病作用,但是鉴于衰老模型的高造模成本和较低成功率,神经退行性疾病模型多采用药物急性造模,下面列举了水飞蓟素针对体外神经系统受损模型的治疗机制。

2.5.1 抗神经毒性作用 在丙烯酰胺诱导的PC12细胞神经毒性体外模型中,水飞蓟素可以通过清除PC12细胞内的ROS并参与激活GSH代谢的Nrf2-Gpx-GCLm/GCLc信号通路来发挥保护神经细胞功能[17]。另外,在硝普钠诱导的亚硝化应激损伤中,水飞蓟素可以通过其强大的清除自由基功能增加PC12细胞的MMP和ATP水平来减轻损伤程度。

2.5.2 抗帕金森病(PD)作用 内毒素(LPS)是最广泛的PD体外模型[33]神经毒性诱导剂。在该模型中,水飞蓟素主要通过其抗氧化和抗炎作用,抑制小胶质细胞的激活来保护多巴胺能神经元免受LPS诱导的神经毒性;水飞蓟素还可以减少超氧阴离子(O2-)和TNF-α的产生,同时抑制一氧化氮合酶(iNOS)活性;通过下调NF-κB途径减少促炎细胞因子的产生、减少白细胞募集或细胞存活,在炎症的发病机制中发挥重要作用,水飞蓟素还能对NF-κB及其下游MAPK通路p38的构成造成抑制作用[16]。

2.5.3 抗阿尔兹海默症(AD)作用 在肠-脑轴领域研究中,Shen等[34]发现水飞蓟素可能通过调节肠道微生物群发挥对AD模型小鼠发挥治疗作用。表明水飞蓟素可能可以减轻APP/PS1小鼠的记忆障碍,同时对肠道微生物区系组成有调节作用,提出了通过干预肠-脑轴起到改善AD症状的可能性。

2.6 抗病毒作用 在水飞蓟素的抗病毒研究中：水飞蓟素自用于医疗以来就被发现其可以抵抗鹅膏菌毒素,其具有阻止鹅膏菌毒素进入肝细胞的能力,研究表明蘑菇鹅膏菌中毒后大约48 h内给予水飞蓟素似乎是防止肝损伤恶化的有效措施[35],但其具体抗病毒机制与抗氧化作用是否有关在这篇报道中尚未提及。肠道病毒A71(EV-A71)是一种主要的神经毒力因子,可导致严重的手足口病(HFMD),并与神经系统并发症和死亡有关,Labani等[36]证实水飞蓟素通过与VP1相互作用,扰乱病毒的附着和剥离,从而抑制EV-A71,并且发现在体外细胞实验中具有发挥细胞外抗病毒作用的额外优势。马亚罗病毒(MAYV)诱导的细胞内氧化应激是MAYV诱导甲型病毒的主要致病机制,水飞蓟素作为抗氧化药物在其中发挥抗病毒作用[37],这可能也是水飞蓟素抵抗类似乙型肝炎病毒(HCV)等的作用机制,这也提示了水飞蓟素的抗氧化性在抵抗病毒进入人体后发挥损伤机制前的可能性,为研究水飞蓟素抗病毒性作用机制提供了新的思路。

2.7 针对其他非典型慢性病

2.7.1 抗慢性并发症 许多慢性疾病并不直接引起机体的严重损伤,而是通过影响机体处于偏氧化应激应激态,互相串扰其他疾病互相恶化。如糖尿病是心血管疾病发展的主要危险因素,包括冠心病(CAD)、中风和外周动脉疾病[38],氧化应激损伤在这些病症中都是关键致病因素,水飞蓟素的抗氧化能力对这些疾病都有良好的治疗或预防效果。心肾综合征是肾器官的损伤引起血液流变导致心脏器官受损的主要原因,在慢性肾功能衰竭中,心血管疾病是死亡的主要原因,心脏和肾脏的表现是密切相关的,其中之一的急性或慢性功能障碍不可避免地反映在另一方,当其中某一器官衰竭时,会进而启动或加重另一器官的衰竭与病变,Abdelsalam等[38]提出水飞蓟素和葡萄籽提取物可以显著激活大鼠中Nrf2/Keap1通路,进而上升抗氧化能力来抵抗阿霉素(DXR)体内诱导的心肾功能衰竭,尽管二者单一使用的效果不显著。脑血管异常生成[39]是糖尿病患者的并发症之一,其原因是糖尿病引起的全身性的氧化应激,在糖基化终产物(AGE)诱导的脑内皮细胞体外糖尿病模型中,发现水飞蓟素可能通过下调脑内皮细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)减少了血管内皮生长因子(VEGF)的释放来发挥对脑血管的保护作用。

2.7.2 慢性肠炎 炎症性肠病(IBD)与ROS的过度产生密切相关,Nguyen等[40]开发的新型水飞蓟素纳米制剂——含二氧化硅氧化还原纳米粒(SiRNP),可以有效地改善水飞蓟素在血液中的吸收,并将其输送到结肠靶组织来提高水飞蓟素的生物利用度。在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的体内小鼠肠炎模型中,其清除2,2-二苯基-1-苦基肼自由基、抑制一氧化氮和促炎细胞因子的释放,显著提高体内外抗氧化、抗炎能力,并且效果优于游离水飞蓟素和对照水飞蓟素纳米粒。

2.7.3 慢性肺炎 除肝脏外,脑和肺是氧化应激风险最高的两个最易受影响的重要器官[41]。肺是大气和生物体间进行气体交换的第一器官,最容易受到氧化应激的影响,也是低压缺氧的第一反应器,Paul等[41]采用包裹50 mg·kg-1的水飞蓟素均质水悬浮液作用缺氧模型SD大鼠,显著上调过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和还原型谷胱甘肽,成功地将ROS降低,并增强抗氧化防御。在油酸诱导的慢性肺损伤模型中[42],水飞蓟素具有保护肺免受氧化应激作用,因其能够减少一氧化氮的产生,减少炎症细胞的浸润,抑制髓过氧化物酶的活性,降低促炎介质,并显示出类似的增强抗氧化防御酶系表达功能。

2.7.4 慢性皮肤病 紫外线(295～400 nm)波长刺激皮肤引发损伤类型主要是ROS的生成。Vostálová等[43]研究结果表明,通过测定水飞蓟素抗氧化和紫外线屏蔽性能,发现水飞蓟素及其黄酮类化合物可能是有效的皮肤保护剂,可以抵御全光谱太阳辐射的有害影响,包括减缓皮肤老化;另外Pientaweeratch等[44]的研究也证实了水飞蓟素具有较强抗弹性蛋白酶功能,再结合其本身的抗氧化作用,在抗皮肤衰老方面也有显著效果。

3 总结与展望

水飞蓟素作为传统的护肝药物几乎对人体没有毒性,本身具有强大的抗氧化、抗炎/抗纤维化、抗肿瘤、抗病毒、保护心脏和改善代谢综合征等作用。其中最主要的抗氧化作用对于氧化应激引起的各类慢性疾病都有展现出良好的治疗效果,临床用途和抗氧化研究前景十分广阔。但其生物利用度问题限制了该药物的使用,如何采用最经济的制剂方法或是药物联用方法来补足药剂学的短板是重中之重。今后的研究重点可以侧重于水飞蓟素在临床体内药代动力学的研究,以及体内游离水飞蓟素的不同靶器官的抗氧化机制的差异。