不同种类冷冻保护剂对海带配子体及孢子的毒性评价

钱瑞 陈书秀 罗世菊 赵聚萍 李晓捷

摘 要：为筛选用于海带超低温保存的冷冻保护剂，采用10%二甲基亚砜（DMSO）、10%甘油、10%蔗糖、10%乙二醇、10% DMSO+10%甘油、10% DMSO+8%葡萄糖、10% DMSO+10%蔗糖、10% DMSO+10%甘油+8%葡萄糖、10% DMSO+10%山梨醇等9种单一或复合冷冻保护剂，在0～4 ℃条件下分别对海带配子体和孢子进行处理，对配子体处理30 min、60 min、24 h，对孢子处理15、30、60 min，通过统计配子体细胞的存活率以及孢子萌发成配子体的比例，对不同种类的冷冻保护剂进行毒性评价。结果表明：9种冷冻保护剂均对海带配子体和孢子有一定的毒性作用，并且毒性随着处理时间的延长而增强。10% DMSO对海带配子体细胞的毒性最小，处理60 min后配子体细胞的存活率为100%；其次是10%乙二醇，处理30 min后配子体的存活率为100%；含10%甘油的单一或复合冷冻保护剂对配子体细胞毒性较大，处理后配子体的成活率显著低于DMSO和乙二醇组（P＜0.05）。单一冷冻保护剂对海带孢子的毒性显著低于复合冷冻保护剂，除10%甘油组处理30、60 min外，其他单一冷冻保护剂试验组的配子体发生率均在60%～80%。

关键词：海带；配子体；孢子；冷冻保护剂；毒性

保护和利用好海带种质资源可为提高海带品种水平、实现海带良种化生产提供重要保证。20世纪70年代末，我国研究人员发现，在人工培养条件下，雌、雄配子体能形成无性繁殖系（克隆），并能产生配子，从而开始了海带种质保存技术的研究［1-4］。在海带配子体世代，将单个配子体分离，使其在适宜的培养条件下进行无性繁殖，以无性繁殖系的形式进行海带配子体的继代培养保存。此法基本实现了海带种质的长期保存，但也存在明显不足：采用液体培养保存一般需要在半个月内更新1次培养液，工作量大，操作繁琐，频繁操作也增加了种质污染及混杂的概率；在采孢子前无法对种海带进行无菌处理，不能杜绝微生物尤其杂藻的污染；培养过程中细胞形态异常、单性生殖等现象时有发生［5-7］。因此，该保种技术还不能做到种质永久保存，无法完全排除混杂、污染、变异的可能性［8］。大量研究表明，生物细胞、组织、器官、胚胎甚至个体在超低温（-196 ℃）状态下代谢完全停止，生命可以在这种静止的状态下被长期保存，解冻后又可恢复其原有的生物活性和遗传特性［9］。超低温保存技术既避免了在传统的动、植物组织和细胞培养过程中可能发生的染色体、基因组和基因水平上的变异，又保存了细胞的活力和形态发生的潜能［10-13］。水生动物、藻类和微生物的细胞超低温保存技术是建立水生生物种质资源细胞库、胚胎库和基因库的基本技术，将有效解决藻类种质保存中污染、混杂、变异等问题，从而实现藻类种质的永久保存。

海带生活史包括肉眼可见的孢子体和显微可见的配子体两个世代，其中配子体世代包括游孢子、胚孢子和配子体3个阶段。通常海带种质保存是以丝状体作为材料，但丝状体是由人工分离的单个配子体培养而成，由于培养空间、操作方法等的限制，大数量株系的保存很困难，保存有限株系又难以满足遗传多样性研究和应用。相反，孢子悬液含有大量的孢子，对其进行冻存可保存大量的株系［14］。因此，研究海带配子体和孢子的超低温冷冻技术有利于推动海带种质保存技术的发展。冷冻保护剂的应用在超低温保存技术发展中具有里程碑作用，使用毒性小、高效的冷冻保护剂是海带种质超低温冷冻保存成功的关键。

本研究以海带配子体和孢子为试验对象，采用单一或复合冷冻保护剂对其进行不同时长处理，通过统计海带配子体细胞的存活率及海带孢子萌发成配子体的比例，对不同种类的冷冻保护剂进行毒性评价，并筛选出毒性作用小且有效的冷冻保护剂，以期为海带种质超低温冷冻保存冷冻保护剂的选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用海带配子体为国家海藻与海参工程技术研究中心海藻种质库保存的901海带配子体克隆系，编号为019601018。海带孢子从叶片表面长有孢子囊的成熟海带（901）中采集获得。

1.2 冷冻保护剂种类及配比

试剂购自国药集团化学试剂有限公司。以煮沸冷却的海水为基础液，按表1中的成分和比例配制9种单一或复合冷冻保护剂。配制好的冷冻保护剂存放在0～4 ℃冰箱中备用。

1.3 配子体克隆系预处理

取適量配子体（编号019601018）克隆团，用智能型超声波细胞粉碎仪（型号JYD-650，上海之信仪器有限公司）进行细胞粉碎。粉碎机实际功率为250～300 W，超声时长6 s，超声次数4次，每次间隔时间5 s。粉碎的细胞液用孔径38 μm的筛绢过滤至消毒的培养皿中。培养皿放置在低温弱光［4～8 ℃、1～2 μmol/（m2·s）］条件下静置培养1周，备用。

1.4 海带孢子的获得

选取成熟度好的种海带，剪下长有孢子囊的小块，经冲洗、擦拭、消毒处理，加低温海水，大量放散游孢子后，将经孔径38 μm筛绢过滤的游孢子液倒入各培养皿中，使孢子附着于培养皿底部。

1.5 冷冻保护剂对海带配子体的毒性影响

1.3中所述预处理的配子体细胞经1周静置培养后得以恢复，且附着于培养皿底部。将培养皿中的培养液倒掉，加入事先预冷的各组冷冻保护剂，作为试验组；以未添加冷冻保护剂的海水培养组作为对照组；每组均设3个平行。所有处理组均在0～4 ℃条件下分别处理30 min、60 min、24 h，结束后更换普通海水培养液，然后统计细胞的存活率。每组计数200个细胞，统计存活细胞数占总细胞数的百分比。

1.6 冷冻保护剂对海带孢子的毒性影响

当1.4中所述的培养皿底部附着的孢子达到一定密度时，倒净孢子液，重新加入事先预冷的低温冷冻保护液，在0～4 ℃条件下分别处理15、30、60 min。处理结束后，在保证孢子体附着的前提下，用海水培养液冲洗10次以上，以最大程度减少冷冻保护剂的残留。所有处理组均添加普通海水培养液，放置在温度8～10 ℃、光强22～24 μmol/（m2·s）、光周期12（L）：12（D）（即光照时间和黑暗时间各为12 h）条件下培养，88 h后统计配子体发生率（即胚孢子体萌发成配子体的比例）。配子体发生率即细胞内含物集中于萌发管顶端的细胞数量占总细胞数的百分比。每个处理组计数细胞200个。

1.7 统计分析

采用双因子方差分析检验不同保护剂和处理时长对配子体存活率和孢子的配子体发生率的影响，采用相同冷冻保护剂、在相同处理时长下进行单因子方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncans方法进行差异显著性分析。用Levens-test进行方差齐性检验，必要时进行数据转化。设P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。所有统计分析均采用SPSS 19.0软件完成。

2 结果

2.1 冷冻保护剂对海带配子体的毒性评价

冷冻保护剂的类型、处理时长及两者的交互作用均对配子体成活率有显著的影响（见表2）。冷冻保护剂种类的偏Eta2值（0.980）>处理时长的偏Eta2值（0.855）>保护剂种类×处理时长的偏Eta2值（0.578），表明这3个因素对海带配子体存活率的影响效应为：保护剂种类>处理时长>两者的交互作用。

不同冷冻保护剂及不同处理时长下配子体的成活率见表3。从表3可以看出，除10%乙二醇和10%甘油外，用其他冷冻保护剂处理24 h后，配子体的成活率显著低于处理30、60 min的（P＜0.05）。10%甘油组处理24 h的成活率也显著低于处理30 min的（P＜0.05）。用10%乙二醇和10% DMSO处理30 min以及用10% DMSO处理60 min，配子体的存活率均为100%。在相同处理时长下，含有10%甘油的单一或复合冷冻保护剂对配子体细胞的毒性作用较大，配子体细胞的成活率均低于45%，显著低于其他单一冷冻保护剂组（P＜0.05）。

2.2 冷冻保护剂对海带孢子的毒性评价

冷冻保护剂的类型、处理时长及两者的交互作用均对孢子萌发配子体的形成率有显著的影响（见表4）。冷冻保护剂种类的偏Eta2值（0.979）>处理时长的偏Eta2值（0.891）>保护剂种类×处理时长偏Eta2值（0.787），表明这3个因素对孢子萌发配子体的影响效应为：保护剂种类>处理时长>两者的交互作用。孢子经不同冷冻保护剂处理不同时间后，在温度8～10 ℃、光强22～24 μmol/（m2·s）的条件下培养88 h，其配子体发生率的统计结果见表5。

从表5可以看出，除10% DMSO、10%乙二醇和 10%DMSO+10%甘油+8%葡萄糖组外，其他冷冻保护剂组处理60 min后，配子体发生率显著低于15 min和30 min时，前两种在30、60 min间差异不显著。10%甘油处理15 min后，配子体发生率显著高于处理30 min（P＜0.05），其他单一冷冻保护剂处理15 min和30 min时的配子体发生率差异不显著（P＞0.05）。单一冷冻保护剂组配子体发生率显著高于复合冷冻保护剂组，除10%甘油的30、60 min 2个试验组外，其他单一冷冻保护剂试验组的配子体发生率均在60%～80%。

3 讨论

3.1 冷冻保护剂对海带配子体的毒性评价

抗冻保护剂的应用在超低温保存技术的发展中具有里程碑作用，能有效减少超低温保存时冷冻对细胞造成的损伤。但多数保护剂对细胞有一定的毒性，毒性大小与使用浓度及处理时间有关［15-16］。在藻类种质冷冻保存中，最常用的保护剂是二甲基亚砜（DMSO）、甘油和甲醇，其中DMSO的使用最为普遍。Zhang等［17］研究发现，DMSO是对海带配子体毒性最小的抗冻保护剂，它可以快速渗透到细胞质内发挥作用。本研究也得出了相似的结论。本试验中采用的冷冻保护剂均对海带配子体细胞有一定的毒性作用，随着处理时间的延长，其毒性作用随之增强，其中10%DMSO对配子体细胞毒性最小，处理60 min，配子体细胞的存活率为100%，处理24 h，配子体细胞的存活率在70%以上。

3.2 冷冻保护剂对海带孢子的毒性评价

曲善村［14］研究了海带游（胚）孢子超低溫保存技术，发现DMSO、甘油、蔗糖、葡萄糖及山梨醇对海带孢子均有毒性，其中DMSO是对孢子毒性最小且对冻存最有效的抗冻保护剂，采用5% DMSO平衡50 min以内，10% DMSO或甘油平衡15 min以内，均可获得70%以上的配子体发生率。本研究也得出了相似的结论。试验中所使用的冷冻保护剂均对孢子有一定的毒害作用，不仅影响了孢子的配子体发生率，而且延缓了配子体发生。采用10% DMSO、10%蔗糖、10%乙二醇处理海带孢子60 min以内，可获得60%以上的配子体发生率。经复合保护剂处理的孢子萌发成配子体的百分比显著低于单一保护剂，说明复合保护剂对海带孢子的毒性高于单一抗冻保护剂。此结果与在某些微藻、紫菜、萱藻等的研究［18-23］中得出的结果有所差异。在这些藻类的超低温保存中，使用复合保护剂比单一保护剂的效果好，复合保护剂可以减轻或消除单一保护剂成分对细胞产生的毒害作用，而且各种保护剂的作用可以相互协调，共同作用。

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Abstract： In order to screen the cryoprotectants of ultra-low temperature preservation of kelp，nine single or compound cryoprotectants including 10% Dimethyl sulfoxide（DMSO），10% glycerol，10% sucrose，10% ethylene glycol，10% DMSO+10% glycerol，10% DMSO+8% glucose，10% DMSO+10% sucrose，10% DMSO+10% glycerol+8% glucose，and 10% DMSO+10% sorbitol were used to treat the gametophytes and spores of kelp for 30 min，60 min，24 h and 15 min，30 min，60 min，respectively，at 0-4 ℃.The toxicity of different cryoprotectants was evaluated by calculating the survival rate of gametophyte cells and the proportion of spores germination.The results showed that all the 9 cryoprotectants had certain toxic effects on gametophytes and spores of S. japonica，and the toxicity increased with the extension of treatment time.The toxicity of 10% DMSO to gametophytic cells was minimal，and the survival rate of was 100% after 60 min treatment，followed by 10% ethylene glycol.The survival rate of gametophyte treated with single or compound cryoprotectant containing 10% glycerol was significantly lower than that of DMSO and ethylene glycol groups（P<0.05）.The toxicity of single cryoprotectant was significantly lower than that of compound cryoprotectant，the incidence of gametophyte treated with single cryoprotectant was 60%-80% except 10% glycerol group treated for 30 min，60 min.

Key words： Sacchatina japonica; gametophyte; spore; cryoprotectant; toxicity

作者簡介：钱瑞（1979—），女，工程师，研究方向为大型海藻种质资源保存及遗传育种。E-mail：359148694@qq.com。

通信作者：陈书秀（1983—），女，高级工程师，研究方向为海藻种质资源保存及遗传育种。E-mail：chenshuxiu124@163.com

项目资助：山东省重点研发计划重大科技创新工程项目（2022LZGC004）;财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系 （CARS- 50）;山东省农业良种工程项目（2021LZGC004）;国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2018YFD0901500）;山东省现代 农业藻类产业技术体系（SDAIT-26）;烟台市校地融合发展项目。