甜菜碱对盐胁迫下马鞭草种子萌发及幼苗生长的影响

崔 行，华智锐，2*

（1.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000；2.商洛市秦岭植物良种繁育中心，陕西 商洛 726000）

柳叶马鞭草(Verbena bonariensisL.)是马鞭草科(Verbenaceae)马鞭草属(Verbena)中的多年生草本植物，也被称为风颈草，原产于南美洲巴西和阿根廷等地［1］，有清热、止血、利尿、消炎的功效，其根可治疗红白痢疾等疾病，已被列入《中国药典》［2］。近年来，柳叶马鞭草以其摇曳的姿态、优雅的色泽、芬芳的花序和较长的开花期而受到园林工作者的青睐，其大规模种植的景观效果尤为壮观，很受观光游客的喜爱［3］。

随着柳叶马鞭草药用和观赏价值逐渐被开发，其市场需求量也在不断地增加，迫切需要对其进行大规模繁殖及开展种植方面的相关研究。罗丽［2］通过综合指标加权比较，得出了柳叶马鞭草在湖南省适宜种植的草本地被植物中排名第6位。商旭文等［4］通过对柳叶马鞭草栽培试验研究发现，柳叶马鞭草的定植时间应为每年的5月10日前后，且其对土壤、水肥的要求严格。闫雪梅等［5］研究了柳叶马鞭草在金昌地区的适应性表现及栽培技术要点。国外专家通过对柳叶马鞭草扦插方面的研究发现，经过生根促进剂处理的插条的生根数量增多，柳叶马鞭草小苗扦插生根率在95%以上［6］。马会利等［3］研究表明，一定浓度的赤霉素对柳叶马鞭草种子发芽有显著影响，对柳叶马鞭草种子发芽有促进作用。周亮［1］研究了NAA和IBA生根剂对柳叶马鞭草插条生根的影响。郭艳超等［7］对柳叶马鞭草耐盐性进行了研究，结果表明：盐胁迫下柳叶马鞭草种子具有相应的耐盐性。综上所述，国内外有关柳叶马鞭草的研究主要集中在基本形态特征、栽培技术和园林应用特性等方面。

目前，土壤盐分破坏被认定为农业生产中的难题，盐胁迫威胁着世界上大部分的耕地和灌溉地，盐渍会使土壤硬化，导致土壤利用率降低，其通过抑制植物根和芽的生长而破坏植物的新陈代谢，从而限制其生长发育，降低作物的质量和产量［8］。柳叶马鞭草作为一个常用的农业生产品种，具有极其重要的药用和观赏价值，然而却受到了盐胁迫的极大破坏。前人研究发现，添加外源性调节物质可以提高植物对盐胁迫的耐受性［9-11］，如甜菜碱(Glycine betaine，GB)。甜菜碱作为常用的渗透调节物质，具有维持细胞渗透压，保护酶活性，耐盐，影响无机离子的分布等作用，可缓解植物生长过程中受到盐害的影响［10-12］。近年来关于甜菜碱在植物抗逆中的作用已有大量研究，认为甜菜碱参与细胞的渗透调节［13］，且还具有极为重要的“非渗透调节”功能［14-15］。但外源甜菜碱对盐胁迫下马鞭草种子萌发及幼苗生理特性的影响研究未见报道。因此，本试验采用NaCl溶液模拟盐胁迫，研究分析了外源甜菜碱对柳叶马鞭草种子萌发及幼苗生理指标的影响，旨在为盐碱地种植的柳叶马鞭草的优质高产栽培、逆境生理机制及抗性育种研究提供一定的理论参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用马鞭草种子由江苏省宿迁市国际花木城提供，经旱区作物逆境生物学国家重点实验室鉴定，为马鞭草科马鞭草属柳叶马鞭草的干燥成熟种子，是农业生产中常用的种子。

选择大小一致、籽粒饱满的种子进行试验；选取株高在10～15 cm之间、生长状况基本一致的幼苗，移栽至塑料花盆中，定时浇水松土，使其恢复到正常生理状态后再进行后续试验处理。

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒 首先用75%乙醇与1% HgCl2对柳叶马鞭草种子进行消毒处理15 s，再将消毒后的种子用温水浸泡12 h，备用［8］。

1.2.2 预试验设计 分别用蒸馏水和分析纯NaCl，配制1、2、3、4 g/L NaCl溶液处理柳叶马鞭草种子，再用蒸馏水作为对照进行种子萌发试验。培养皿中放入2层滤纸，添加10 mL NaCl处理液，使滤纸浸湿饱和，后放入100 粒种子至培养皿，共5组，每处理重复3次。通过分析柳叶马鞭草的种子萌发指标和幼苗生物量下降到50%时的NaCl浓度，得出盐胁迫的质量浓度阈值为2 g/L。

1.2.3 种子萌发试验 在2 g/L NaCl的胁迫下，设定浓度分别为1、3、5、7 g/L甜菜碱处理，对应标记为T1、T2、T3、T4处理。将无盐胁迫及未添加外源甜菜碱条件下生长的柳叶马鞭草种子设为蒸馏水对照(CK1)，将盐胁迫下未添加外源甜菜碱溶液处理的柳叶马鞭草种子设为盐胁迫对照(CK2)，共6组试验处理。放入100粒马鞭草种子在对应培养皿中，每处理重复3次，置于25 ℃恒温培养箱中，每天添加5 mL对应浓度的甜菜碱(CK1和CK2均添加5 mL蒸馏水)，分别于处理4、8 d后统计其发芽势、发芽率。

1.2.4 幼苗盆栽试验 待种子萌发后幼苗长至10～15 cm时移栽到直径为15 cm×20 cm的花盆中(园土∶蛭石=1∶1)培养(每盆栽3株)，保持幼苗植株良好的生长状态，并定期浇水培养15 d后，选取长势一致的柳叶马鞭草幼苗，采用灌根的方法，每盆浇灌2 g/L NaCl处理液200 mL(CK1浇灌200 mL蒸馏水)，确保处理液渗透而不漏出。同时，对每株幼苗叶片喷洒浓度分别为1、3、5、7 g/L的甜菜碱5 mL(CK1和CK2均喷洒蒸馏水5 mL)，每个处理3次重复。幼苗培养10 d后取样，并测定幼苗的相关生长和生理指标。

1.2.5 种子萌发指标的测定 萌发的标志为胚根伸出种皮。分别于处理的第4、第8天计算其发芽势、发芽率［2］。计算公式为：

发芽势(%)=发芽初期(第4天)发芽种子数/供试种子总数×100%

发芽率(%)=发芽终期(第8天)发芽种子数/供试种子总数×100%

1.2.6 幼苗生长指标和生理指标的测定 采用直尺测定幼苗根长(cm)和株高(cm)，采用天平测定幼苗鲜重(g)和干重(g)。超氧化物歧化酶(SOD)、 过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照李合生［16］的方法。丙二醛(MDA)含量的测定参照张志良等［17］的硫代巴比妥酸(TBA)检测法，用少量1 mol/L NaOH溶解0.6 g TBA，再用10% TCA 定容至100 mL，即为MDA反应液。可溶性蛋白含量的测定：将0.1 g G-250用50 mL 90%乙醇溶解，用100 mL 85%磷酸定容至1000 mL，再过滤备用，20 μL酶液混合3 mL G-250后放置2 min，同时以20 μL缓冲液混合3 mLG-250作空白对照［18］，于波长595 nm下测定其吸光度。叶绿素含量的测定参照张志良等［17］的丙酮—碳酸钙法。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对所测数据进行统计分析，用平均值±标准误表示测定结果，分别对不同浓度外源甜菜碱处理进行单因素方差分析，取3次重复测得的各项指标数据平均值，并采用Excel 2010软件制图和分析。

2 结果与分析

2.1 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草种子萌发指标的影响

从表1可看出，在NaCl胁迫下，随着GB浓度的增加，T1～T4处理的发芽率、发芽势均呈现先增后降的趋势。在GB浓度为3 g/L(T2)时，柳叶马鞭草种子的发芽率和发芽势最高，分别为52.67%和42.67%，与CK2盐胁迫对照相比，显著上升且增加幅度分别高达21.33、19.67个百分点，且差异显著(P＜0.05)。由此可知，添加甜菜碱可以缓解盐胁迫对柳叶马鞭草种子萌发的抑制作用，其中GB浓度为3 g/L时的作用效果最佳。

表1 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草种子萌发的影响 %

2.2 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗生长的影响

由表2可知，与CK1对照相比，在CK2的盐胁迫处理下，柳叶马鞭草幼苗的根长、株高、鲜重和干重均显著降低；但与CK2相比，添加不同质量浓度外源甜菜碱后，盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗各生长指标均不同程度地升高，在GB浓度为3 g/L(T2)时，盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗的根长、株高、鲜重和干重增加幅度最大，分别增加了57.97%、22.11%、46.03%、55.73%。这表明适量甜菜碱可以有效地缓解盐胁迫对柳叶马鞭草幼苗生长的影响，且添加3 g/L甜菜碱的缓解效果最佳。

表2 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗生长的影响

2.3 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗保护酶活性的影响

由图1～图3可知，与对照组(CK1)相比，在2 g/L NaCl胁迫(CK2)下，SOD、CAT的活性呈显著上升趋势(P＜0.05)，增幅分别为26.67%、16.15%；POD活性呈显著下降趋势(P＜0.05)，降幅为33.47%，说明NaCl胁迫处理对柳叶马鞭草叶片3种保护酶活性有显著影响。在同一浓度NaCl的胁迫下，经不同浓度GB处理(T1～T4)后，相比于CK2，柳叶马鞭草幼苗的SOD、POD活性均呈现先升后降趋势，而CAT活性呈现先降后升再降的趋势。其中，3种保护酶活性均在T2(3 g/L GB)处理下达到最大增幅且与其他处理差异显著(P＜0.05)。说明在NaCl胁迫下，GB处理浓度为3 g/L时可显著提高柳叶马鞭草幼苗保护酶的活性，从而增强马鞭草幼苗对盐胁迫的耐受性。

图1 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗SOD活性的影响

图2 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗POD活性的影响

图3 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗CAT活性的影响

2.4 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗膜脂过氧化的影响

由图4可知，与对照组(CK1)相比，在2 g/L NaCl胁迫(CK2)下，MDA的含量呈显著上升趋势(P＜0.05)，说明NaCl胁迫处理导致柳叶马鞭草叶片MDA的大量积累；在同一浓度NaCl的胁迫下，与CK2相比，不同浓度GB(T1～T4)处理下柳叶马鞭草幼苗的MDA含量呈现出明显降低的趋势，分别下降了12.29%、58.14%、41.79%、25.58%。试验表明，柳叶马鞭草幼苗MDA含量在T2(3 g/L GB)处理下达到最大降幅，且与T1、T3、T4相比差异显著(P＜0.05)。

图4 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗MDA含量的影响

2.5 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗叶绿素含量的影响

叶绿素含量作为植物生理研究的关键指标，它能有效地反映植物的光合能力［19］。由图5可知，NaCl胁迫(CK2)的柳叶马鞭草幼苗体内的叶绿素含量与对照组(CK1)相比有显著下降趋势(P＜0.05)，降幅达38.42%，这表明盐胁迫会降低植物光合色素的含量。但T1～T4处理后的叶绿素含量相比于NaCl胁迫CK2有明显上升趋势，增幅分别为2.62%、74.98%、39.45%、9.97%。表明喷洒不同浓度的甜菜碱可显著提升马鞭草幼苗的叶绿素含量，其中在T2(3 g/L GB)处理下达到最大增幅，说明3 g/L GB处理可以显著降低NaCl胁迫对植物叶片叶绿素含量的影响，从而缓解盐胁迫的伤害程度。同时，从图5还可以看出，T2处理下的叶绿素含量显著高于CK1，这表明适量GB处理有利于马鞭草在逆境条件下积累叶绿素。

图5 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗叶绿素含量的影响

2.6 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影响

由图6可知，与对照组(CK1)相比，在2 g/L NaCl胁迫(CK2)下，马鞭草幼苗的可溶性蛋白含量呈显著下降趋势(P＜0.05)，降幅达69.31%，这表明盐胁迫对马鞭草幼苗叶片的可溶性蛋白含量有明显影响；但在盐胁迫下，添加不同浓度GB 处理(T1～T4)对柳叶马鞭草幼苗的可溶性蛋白含量有提升作用，且相比于CK2呈现出先升后降的趋势，其中在T2(3 g/L GB)处理下的可溶性蛋白含量达到最大增幅。说明在NaCl 胁迫下，添加浓度为3 g/L的GB 可以显著提高柳叶马鞭草幼苗的可溶性蛋白含量。

图6 GB对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影响

3 讨论

3.1 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草种子萌发和幼苗生长的影响

种子萌发是植物生命的开始，是植物生长最重要的一个过程，但也同样是最脆弱的阶段，非常容易受到外界环境的影响［20］。从预试验结果中可看出盐胁迫对柳叶马鞭草种子萌发具有较大的影响。但相关研究表明，在盐胁迫下添加外源甜菜碱明显会改善烟草(Nicotiana tabacum)、枸杞(Lycium barbarum)、番茄(Solanum lycopersicum)和白三叶(Trifolium repens)等种子的萌发情况［21］。此外，罗黄颖等［22］也发现，添加甜菜碱可促进盐胁迫下设施番茄(Lycopersicon esculentumMill)种子的萌发和幼苗生长。本试验通过添加适量的外源甜菜碱，能有效地缓解盐胁迫对马鞭草种子萌发和幼苗生长指标的影响，这与前人的研究结论一致，且本试验得出在GB浓度为3 g/L时的处理效果最佳。

3.2 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草保护酶活性的影响

POD、SOD和CAT均是植物抗氧化系统中的保护酶，能将逆境胁迫条件下产生的H2O2分解为H2O、O2，在植物面对逆境时起自我保护的作用。赵英等［23］研究发现，一定浓度的NaCl胁迫会对植物幼苗的抗氧化酶造成严重的影响，从而表现为相应酶活性的降低。

本试验中，在2 g/L NaCl的胁迫下，柳叶马鞭草幼苗中SOD、CAT的活性均有所上升，充分证明了植物在生长过程中受到盐胁迫伤害时，可通过提高体内相应抗氧化酶的活性，从而达到保持自身正常生理状态的效果，这与陆安桥等［8］在盐胁迫对湖南稷子苗期生长及生理特性影响研究中的结论一致。郭艳超等［7］在柳叶马鞭草耐盐性评价研究中发现，添加一定浓度的NaCl胁迫后，随着时间的变化，其相应的抗氧化酶活性呈现先增后降的趋势。由此可以解释本试验在T1处理添加1 g/L GB后的CAT活性呈下降的趋势，可能是因为在测定时CAT的活性已处于刺激过后的下降阶段。在本试验中，与盐胁迫CK2相比，施加3 g/L GB时，这3种保护酶活性的升高均达到最显著(P＜0.05)，这表明甜菜碱有助于激发柳叶马鞭草幼苗体内保护酶的活性，从而提高植物自身抵御非生物胁迫的能力。

3.3 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗膜脂过氧化的影响

在逆境中受到威胁时，植物体内会产生活性氧自由基，会氧化细胞膜的膜脂，MDA含量可以反映植物在逆境中受到伤害的程度。缪珊等［24］研究表明，随着盐浓度的增加，狼尾草(Pennisetum alopecuroides)的丙二醛含量呈先上升后下降再上升的变化趋势。本研究结果显示，在2 g/L NaCl胁迫下柳叶马鞭草幼苗的MDA含量较对照组CK1显著增加，这与缪珊等［24］的研究结果类似。表明盐胁迫对柳叶马鞭草幼苗的影响较大，使其膜脂发生过氧化，从而MDA含量发生变化。但在添加不同浓度的GB后，其MDA含量均比盐胁迫(CK2)处理显著降低，并在GB浓度为3 g/L时达到最低值，充分说明适量外源甜菜碱能有效缓解马鞭草幼苗膜脂过氧化伤害程度。

3.4 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗叶绿素含量的影响

叶绿体色素是绿色植物进行光合作用的物质基础，光合作用生产的变化和威胁因素对植物的影响程度都通过其含量的变化来体现。本试验发现，与对照组CK1相比，在2 g/L NaCl胁迫下柳叶马鞭草幼苗的叶绿素含量明显降低，这与张强等［25］得出的盐胁迫下叶绿素含量呈减少趋势的研究结果一致。本试验研究还发现，添加不同浓度的GB处理后，柳叶马鞭草幼苗的叶绿素含量呈现出先上升后降低的变化趋势，且GB浓度为3 g/L时达到最高值，这与翟乃家等［26］的研究结果一致，充分表明在盐胁迫下添加适量甜菜碱，会促进柳叶马鞭草幼苗叶片叶绿素的积累，从而缓解盐胁迫对光合作用的抑制作用。

3.5 甜菜碱对盐胁迫下柳叶马鞭草幼苗可溶性蛋白含量的影响

在盐胁迫下，为了维持细胞正常的渗透压，植物体会储存大量的可溶性蛋白，以保障植物体正常水分供给。王国霞等［27］发现，施加外源甜菜碱，显著增加了低温胁迫下油茶可溶性蛋白的含量；张涛［28］发现，花楸树叶片的可溶性蛋白含量在盐胁迫下先升高后降低，但当盐浓度高到一定程度时，植物体内合成可溶性蛋白的组织或者酶类就会失活，从而使花楸树的自我调节能力受到抑制。在本试验中，在2 g/L NaCl胁迫下，柳叶马鞭草幼苗的可溶性蛋白含量较CK1显著降低，可以看出盐胁迫处理对柳叶马鞭草植株造成了严重的伤害。但添加不同浓度的GB后，其可溶性蛋白含量均比CK2盐胁迫处理下呈现出明显上升趋势，并在GB浓度为3 g/L时达到最高值，充分说明适宜浓度的外源甜菜碱处理可以缓解柳叶马鞭草幼苗的盐胁迫伤害。

4 结论与展望

本试验研究得出，盐胁迫虽然抑制了柳叶马鞭草种子萌发和幼苗的生长，但添加不同浓度甜菜碱后，与盐胁迫对照相比，种子萌发指标、幼苗生长指标、抗氧化酶活性、叶绿素含量、可溶性蛋白含量等均不同程度升高，MDA含量明显降低，从而有效缓解了盐胁迫造成的伤害。当外源GB浓度为3 g/L时，与盐胁迫对照相比，各指标变化幅度最大，处理效果最显著(P＜0.05)。综上所述，添加外源甜菜碱处理可以缓解盐胁迫对柳叶马鞭草种子萌发和幼苗生长造成的伤害程度，且GB浓度为3 g/L时的作用效果最佳。但本研究仅开展了马鞭草种子萌发和幼苗盆栽试验，对逆境条件下更深层次的抗性生理和分子机制方面的研究有待进一步开展。