血管支架植入对血管平滑肌细胞的影响

周昌颐 王瑞 沈雳

(复旦大学附属中山医院心内科 上海市心血管病研究所,上海 200032)

药物洗脱支架(drug-eluting stent,DES)在经皮冠状动脉介入治疗中的应用,显著降低了血运重建后不良事件的发生率,但支架内再狭窄和支架内新生动脉粥样硬化等晚期并发症仍旧影响支架植入患者的远期预后[1]。近年来被寄予厚望的生物可降解支架(bioresorbable stents,BRS)仍未能减少支架相关并发症的发生[2],BRS吸收过程中局部降解产物的聚集,使其存在独特于DES的血管交互机制。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是动脉血管中膜的主要细胞成分,支架植入后与支架表面直接接触,其增殖、迁移、凋亡等生物学行为与不良事件的发生密切相关。因此,更好地理解支架植入对VSMC行为的影响,将有助于现有器械的优化和改进,并为未来创新治疗手段的开拓提供理论基础。现就血管支架植入对VSMC的影响做简要综述。

1 VSMC的表型

生理情况下动脉血管中膜中的VSMC形态细长,呈长梭形,似纺锤,主要表达细胞骨架蛋白家族,如肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和平滑肌细胞特异性抗原[3],此时VSMC细胞周期停滞、增殖和迁移能力低下,主要参与动脉的收缩与舒张,从而调节器官和组织的血流量,故称其为收缩表型[4]。收缩表型并不是VSMC分化的终末,在包含丝裂原和各种生长因子的血清等刺激下,VSMC能够重编程、去分化,重新进入细胞周期,开始增殖[5]。

具有增殖能力的VSMC形态转变为菱形,迁移能力增强,并且上调了与细胞外基质相关蛋白的表达丰度,呈现合成表型。一般将VSMC从收缩表型去分化成为合成表型的这一过程称为表型转换[6]。VSMC的表型转换促进了肺动脉高压[7]和动脉瘤[8]等疾病的发生发展,合成表型的VSMC能够合成、分泌过量细胞外基质,增加动脉血管的硬度,并且能够迁移至血管内膜后过度增殖导致内膜增厚,以及血管腔狭窄[9]。

血管支架植入诱导VSMC成为表达c-Kit的干细胞表型,参与血管修复[10],并且通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路[11]、Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)通路[12-13]将自身转化为合成表型,导致新生内膜过度增殖。

近年来随着单细胞测序技术的蓬勃发展,从病理性血管组织中鉴定出了更多VSMC亚群[14],提示VSMC具有高度的异质性,但其与支架植入后并发症的关系尚未完全阐明。一般认为VSMC还具有以下表型：(1)间充质细胞样表型：VSMC收缩能力下降,增殖能力增强,高表达间充质细胞具有的标志物,如SCA1、CD34及CD44;(2)纤维细胞样表型：VSMC更多参与到细胞外基质蛋白的分泌过程,高表达胶原蛋白(如COL1A1)及蛋白聚糖(如DCN、BGN),与间充质细胞样表型的VSMC一同导致新生内膜过度增殖和血管僵硬[15];(3)巨噬细胞样表型：通过获得巨噬细胞标志蛋白(如LGALS3、CD45及CD68),VSMC能够吞噬脂质并继续分化为泡沫细胞[16];(4)成骨表型：成骨相关的转录因子(如MSX2、RUNX2及SOX9)被激活,合成分泌含生物矿化相关碱性磷酸酶的囊泡至细胞外胶原纤维致使钙盐沉积,最终导致血管钙化[4];(5)脂肪细胞样表型：功能类似棕色脂肪细胞[17]。目前鲜有研究验证VSMC的表型在支架植入后的变化,尚需进一步明确不同表型是否参与了支架植入后血管修复的过程。

2 机械作用的影响

血管中膜的VSMC、胶原纤维及弹性纤维是血管壁主要的承力结构,维持着血管的弹性和张力。血管支架植入后管壁被拉伸,产生强周向应力。细胞表面的整合素、非选择性阳离子通道和一些G蛋白耦联受体可将这些机械性牵拉信号转导至细胞内,使黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、血小板衍生生长因子受体α等发生磷酸化,进而通过Rho、MAPK及PI3K/Akt等通路,激活p53,促使DNA片段化,使VSMC发生细胞凋亡[18]。机械性牵拉还能通过升高胞内活性氧水平激活NOTCH信号通路,促进VSMC增殖和表型转换[19]。

FAK是传导细胞外机械信号的关键分子,其作为一种酪氨酸激酶,能够通过其C端的黏着斑靶向结构域接受来自血小板衍生生长因子受体和整合素的信号,进而从细胞质向细胞核穿梭。FAK蛋白的N端能够与S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,SKP2)相互作用促进SKP2的泛素化降解,在被外界信号激活后,VSMC胞内的FAK更多定位于细胞质,细胞核中FAK依赖的蛋白酶体途径对转录因子GATA4和SKP2的降解作用减少,使核内GATA4直接结合cyclin D1基因启动子区域,促进cyclin D1蛋白表达,继而与SKP2结合,使VSMC进入细胞周期[20]。另外,FAK还可通过表观遗传学途径调控VSMC表型。核内DNMT3A的泛素化降解同样受FAK调控,FAK出核能够增加收缩相关基因启动子中的DNA甲基化程度,阻碍收缩相关基因表达,使VSMC发生去分化[21]。血管支架植入伴随着血清中血小板衍生生长因子等化学信号的刺激及血管壁牵拉传递的机械信号刺激,而FAK是两种刺激的共同下游关键蛋白分子,针对其活性的调控将有望成为防止支架植入对血管壁损伤的靶点之一。

3 抗增殖药物的影响

DES使用涂层控制抗细胞增殖药物的释放,主要目的是抑制新生内膜的过度增殖。新生内膜主要由VSMC及细胞外基质如蛋白多糖、胶原等成分构成。动物模型的DES植入后新生内膜组织进行单细胞测序分析结果表明,内皮细胞仅占总细胞数的10%[22],故抑制VSMC增殖应是抗支架内再狭窄的主要靶点。

微管抑制剂紫杉醇促使VSMC静止于M期,阻止其增殖和迁移,是较早应用于DES的抗细胞增殖药物,但部分研究表明其支架内血栓发生率相较其他DES高[23],现已少用。

目前广泛应用于DES涂层的是大环内酯类抗增殖药物雷帕霉素及其类似物(如sirolimus、everolimus、zotarolimus和biolimus A9),主要结合细胞存活和增殖的关键调控蛋白mTOR复合体中的mTORC1[24],进而抑制mTOR通路,促进VSMC向收缩表型转换。

雷帕霉素的应用显著降低了支架内再狭窄率,但却提高了支架内新生动脉粥样硬化发生率[25]。新生动脉粥样硬化定义为支架周围新生内膜内出现带有CD68抗原的泡沫状巨噬细胞簇,伴或不伴钙化、纤维粥样斑块、薄纤维帽粥样斑块和血栓形成破裂[26],但DES引起新生动脉粥样硬化的机制尚未完全阐明。通过谱系追踪技术构建的动脉粥样硬化小鼠模型表明,VSMC可以通过表型转换成为表达CD68表面抗原的巨噬细胞样VSMC[27],利用单细胞技术等分析方法表明其占小鼠动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞总量的30%～70%[4,28]。目前,支架植入后的新生动脉粥样硬化中泡沫细胞的来源尚不明确,VSMC向巨噬细胞样表型转换是否受到抗增殖药物涂层的支架影响也缺乏严格的实验证据,仍需要进一步探索。

近年来也有许多研究尝试在DES上应用新型的抗增殖药物。比如以传统毒性药物砒霜制成的三氧化二砷DES,能够通过阻断VSMC中的YAP/ROCK通路,调节其表型,达到抑制新生内膜的形成、抗支架内再狭窄的效果[13]。

4 聚乳酸及其降解产物的影响

聚乳酸是应用最为广泛的BRS骨架和可降解涂层材料,其最终降解产物为二氧化碳和水被血管壁所吸收,支架梁局部被结缔组织填充修复,而聚乳酸在降解过程中产生的中间产物乳酸可能影响VSMC表型,从而导致不良事件的发生。内源性乳酸是哺乳动物细胞有氧糖酵解的产物,VSMC在钙化培养基中培养时,乳酸含量与有氧糖酵解的关键酶PFKFB3的含量均增加[29]。同时,其他研究[30-31]提示,有氧糖酵解的关键酶乳酸脱氢酶和丙酮酸激酶在VSMC增殖过程中也发挥重要作用,提示Warburg效应参与介导调控VSMC表型。外源性的高乳酸环境能够促进VSMC发生表型转换,增强VSMC细胞的增殖及迁移能力[32],同时抑制BNIP3蛋白调节的线粒体自噬,使线粒体功能受损,从而诱导其氧化应激,促进其分化为成骨表型[33]。一些动物实验和临床研究表明,聚乳酸BRS植入后新生动脉粥样硬化进展明显,支架内血管段钙化进展迅速[34]。以上研究提示聚乳酸及其降解产物影响VSMC的糖代谢过程,通过Warburg效应改变表型,促进增殖并且转化为巨噬细胞样表型以及成骨表型,进而介导支架内再狭窄和新生动脉粥样硬化等不良事件的发生。

5 镁、锌及稀土元素的影响

镁合金因其优越的力学性能和抗栓能力,成为继聚乳酸之后又一理想的BRS骨架材料。镁离子在人体中含量丰富,且是钙的天然拮抗剂,在体外试验中能够抑制高磷诱导的VSMC成骨分化,近年来有研究认为提高钙化易感患者血清中的镁浓度可能有助于预防血管钙化[35]。

在添加有雷帕霉素和镁离子的培养基中体外培养家兔VSMC和家兔内皮细胞时,发现将镁离子浓度从1 mM提高至3 mM并不影响雷帕霉素对家兔VSMC增殖、迁移的抑制作用,但却能显著恢复家兔内皮细胞的增殖和迁移能力[36]。铈、钕、钇和镱等元素的体外试验[37]结果表明,这些稀土元素添加至镁合金中只能使VSMC上调炎症相关基因的表达,但并不引起VSMC凋亡。另外,一项临床前研究[38]表明,镁基BRS与DES相比,新生动脉粥样硬化发生率显著降低。以上研究共同说明,镁合金不仅具有良好的生物相容性,而且可能抑制VSMC向成骨表型转换,是具有良好前景的BRS骨架材料。

与镁类似,锌基支架对新生内膜形成也呈明显的抑制作用[39],能够诱导VSMC产生线粒体融合,提高VSMC的最大和基础耗氧量[40],以及通过激活半胱天冬酶凋亡信号通路促进VSMC凋亡[41]。在高糖环境中,锌离子上调VSMC中的TNFAIP3,抑制VSMC向成骨表型分化[42]。锌具有出色的生物相容性和理想的降解速率,但其机械强度较低,近年来才开始将其作为BRS材料研究,仍需要优化和寻找具有更强机械性能的锌合金。

6 总结与展望

VSMC在支架植入后血管壁愈合、组织重塑及最终支架内再狭窄和新生动脉粥样硬化形成中发挥着核心作用。在这些过程中,VSMC经历了复杂的变化,由收缩型转换为合成型,获得了高增殖和迁移的能力。同时,许多关于VSMC异质性的研究在体外分离鉴定出更多的VSMC亚群,通过鉴定这些可由特定基因/蛋白表征的不同VSMC表型,可更好地阐明VSMC在支架植入后血管修复中的作用,有助于设计预防支架相关不良事件的个体化治疗手段。通过对裸金属支架失败机制的研究,DES得以发展,并成功抑制了再狭窄的发生,但却使新生动脉粥样硬化发生率显著提高。BRS技术的发展旨在通过介入无植入的理念,完成病变血管生理性功能的恢复,但其降解过程中的中间产物也影响着VSMC的生物学行为,对血管重构的结局至关重要。因此,阐明VSMC在血管支架植入后发生表型转换的分子机制,有助于改进血管支架机械支撑物结构、BRS的分子组成及选择理想的涂层药物,或许将引领介入领域的下一场技术革命。