内质网应激在阿霉素心脏毒性中作用的研究进展

王鹏 王鑫 张瑶 张经泽 贺世豪 李瑾

(1.山西医科大学第二临床医学院,山西 太原 030000; 2.山西医科大学第二医院心血管内科,山西 太原 030000)

阿霉素(doxorubicin,DOX)作为一种广谱抗癌药物,广泛用于治疗乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤等恶性肿瘤,但其显著的心脏毒性限制了进一步应用。DOX的心脏毒性机制尚未完全阐明,涉及的机制包括氧化应激、线粒体损伤、铁死亡、炎症、细胞凋亡、纤维化以及自噬调节失衡等,近年来发现内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)及其所介导的凋亡在DOX心脏毒性中发挥了不可忽略的作用,现对ERS及通过以ERS为靶点的相关化合物及药物进行综述。

1 ERS

内质网(endoplasmic reticulum,ER)在蛋白质合成、折叠、修饰、运输以及调节细胞内钙水平等方面发挥重要的作用。当细胞受到各种刺激时,如氧化应激、药物及毒物、缺血缺氧、病原体或病原体相关成分如内毒素,均可引起ER内错误折叠或未折叠蛋白的积累,从而形成ERS,为恢复细胞内蛋白稳态,细胞激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)通路,UPR的激活不仅可影响蛋白质分泌途径的每个环节,包括合成、易位、折叠、成熟、质控和运输,还可影响通过自噬和ER相关蛋白质降解途径消除错误折叠蛋白质的速率[1]。

2 UPR

UPR主要由3种跨膜蛋白及其所介导的级联反应完成,这3种跨膜蛋白分别是蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、肌醇依赖性激酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)和激活转录因子(activating transcription factor,ATF)6。正常生理情况下,ER分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)(又称免疫球蛋白重链结合蛋白质)分别与PERK、IRE1α、ATF6结合,使其处于失活状态[2],而在ERS状态下,未折叠蛋白积聚在ER中,GRP78与上述3种跨膜蛋白解离,从而触发级联效应,并增加蛋白质折叠活动[3]。

PERK激活后可磷酸化真核翻译起始因子2α(eukaryotic translation-initiation factor 2α,eIF2α),降低ER中蛋白质翻译的总速率,同时诱导ATF4的翻译,ATF4作为一种应激诱导转录因子,参与包括维持氧化还原稳态、氨基酸代谢、蛋白质合成、凋亡和自噬等基因的表达。其中,激活生长停滞和DNA损伤诱导基因34(growth arrest and DNA damage-inducible gene 34,GADD34),可编码蛋白磷酸酶1c(protein phosphatase 1c,PP1c)以对抗eIF2α的磷酸化,形成PERK通路的负反馈调节[4],另一个重要的靶基因是凋亡蛋白C/EBP同源蛋白基因(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein,CHOP),它通过靶向调控促凋亡蛋白BIM和抗凋亡蛋白Bcl-2[5],介导细胞凋亡,当PERK信号通路持续激活,会诱导细胞凋亡。

IRE1α具有核酸内切酶活性,在ERS下,IRE1α可寡聚化并自磷酸化以诱导其核酸内切酶活性,可将X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP-1)mRNA中移除一个短序列,并生成剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1 spliced,XBP-1s),XBP-1s可调节参与蛋白质折叠的ER分子伴侣基因的转录,提高蛋白质折叠效率[6]。IRE1α还与细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal regulating kinase-1,ASK1)结合,导致c-Jun氨基端蛋白激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)激活,继而导致细胞凋亡[7]。JNK级联信号转导通路的作用是激活凋亡蛋白,如Bax、Bad、BIM以及转录因子p53,并可抑制抗凋亡基因Bcl-2家族促进细胞凋亡[8]。

ATF6的活性形式是ERS元件的转录激活剂,它从ER转移到高尔基膜,被1位点蛋白酶和2位点蛋白酶切割,释放出含有碱性亮氨酸拉链转录因子的片段(ATF6p50),该片段迁移到细胞核以诱导GRP78、CHOP和XBP-1等基因的转录[9]。

3 ERS在DOX心脏毒性中的作用

经DOX处理后,心肌ER显著扩张[10],心肌细胞ERS蛋白如IRE1α、PERK、ATF6和CHOP及其下游产物水平均有升高[11-12],提示DOX可能导致ERS。当ERS无法纠正时,持续激活的UPR可进一步介导细胞凋亡。

3.1 IRE1α/ASK1通路介导的凋亡

促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联包含三个等级的蛋白激酶：MAPK、促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)。MAPKKK磷酸化激活MAPKK,后者激活MAPK,活化的MAPK可磷酸化多种底物及转录因子,MAPK家族主要包括胞外信号调节激酶、JNK和p38MAPK。ASK1是一种MAPKK,可通过MAPK级联系统激活JNK和p38MAPK[7]。JNK激活后可通过磷酸化抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL以及促进促凋亡蛋白Bax和Bad向线粒体膜的易位,同时还刺激Bax和Bad的表达,以上过程均可导致线粒体通透性增加,将细胞色素C释放到细胞质中,进一步激活胱天蛋白酶(caspase)通路并开始凋亡过程[13-14],JNK还通过Bcl-2途径调节促凋亡蛋白p53的水平和活性[15]。DOX处理后的H9c2心肌细胞中,p38MAPK的表达水平、磷酸化p38MAPK/p38MAPK的比值均有明显升高,提示p38MAPK可能参与由DOX诱导的H9c2心肌细胞凋亡过程[16]。但也有研究发现,在氧化应激背景下,心肌细胞中ASK1选择性激活p38MAPK而非JNK[17],DOX诱导的心脏毒性模型中该结论是否成立尚待研究。

3.2 CHOP信号通路介导的凋亡

IRE1α和ATF6可直接激活CHOP,触发细胞凋亡,PERK需经过ATF4途径间接激活CHOP,CHOP可调节许多抗凋亡和促凋亡基因的表达,包括编码Bcl-2家族蛋白、GADD34蛋白的基因,同时还可通过与死亡受体通路结合并上调死亡受体4和死亡受体5的表达来诱导细胞凋亡[5]。有研究[18]显示在用5 μg DOX处理H9c2细胞0～24 h后,GRP78和CHOP凋亡蛋白的表达以时间依赖性方式显著增加,提示DOX心脏毒性可能与ERS下CHOP介导的细胞凋亡有关。

4 有抑制ERS作用的心脏保护化合物

近些年,许多新的化合物被证实存在心脏保护作用。白藜芦醇是一种多酚化合物,有研究证实其有心脏保护作用,能改善心血管危险因素(高血压、糖尿病和血脂水平)和内皮功能,从而延缓动脉粥样硬化的进展,改善血管功能[19],具有抗纤维化、改善心室重塑作用[20-21]。DOX诱导的H9c2心肌细胞模型中,DOX处理前3 h预防性使用右丙亚胺、卡维地洛和白藜芦醇,组间细胞存活率无明显增加,然而,当提前24 h预防性使用上述3种药物时,白藜芦醇组细胞生存率较其他组明显升高[22],该研究除了提示白藜芦醇可能较右丙亚胺及卡维地洛更有效保护心肌之外,亦提示给药时机可能是心脏保护药物的影响因素。另一项研究显示DOX以时间依赖性的方式诱导ERS相关蛋白的过度表达,DOX处理之前,外源性给予白藜芦醇可降低ERS相关蛋白的过度表达,使H9c2细胞免受DOX诱导的心肌细胞凋亡,提示抑制ERS可能是白藜芦醇心脏保护作用机制之一[18],但该项研究并未对白藜芦醇给药时机进行研究,不同给药时机是否影响ERS相关蛋白的表达尚待进一步研究。

消退素是一种内源性抗炎和促进炎症消退的脂质介质。根据来源可进一步分为D类和E类[23]。有研究[12]显示,消退素D1可改善DOX所致的小鼠心功能不全,消退素D1可降低小鼠心肌中GRP78、CHOP、caspase-12、p-PERK、p-eIF2α和ATF6α的表达水平,提示抑制ERS可能是消退素D1心脏保护作用机制之一。一项研究[24]中显示,消退素D1可减弱ERS诱导的HepG2细胞凋亡,但并未降低HepG2细胞中GRP78的表达,提示消退素D1可能作用于ERS下游发挥抗凋亡作用。这在DOX所致心脏毒性模型中尚需进一步研究。消退素E1与消退素D1同为消退素家族成员,已有相关研究显示消退素E1在DOX心脏毒性中亦有保护作用,消退素E1可改善DOX所致小鼠心功能不全,降低小鼠血清中心肌损伤标志物肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶和脑利尿钠肽的水平。最近的一项研究[25]显示,消退素E1通过调节Akt/mTOR信号通路减轻氧化应激、自噬和凋亡来减弱DOX诱导的心脏毒性,但ERS是否参与消退素E1 DOX心脏毒性保护作用尚待进一步研究。

白细胞介素(interleukin,IL)-10是一种细胞因子,最近发现IL-10具有稳定斑块、改善心脏重构等心脏保护作用[26]。最近一项研究[11]显示IL-10能提高DOX处理后的心肌细胞存活率,可降低ER分子伴侣GRP78、UPR相关蛋白的表达以及XBP-1 mRNA的水平,提示抑制ERS可能是IL-10具有DOX心脏毒性保护作用的原因之一。另外,一系列的研究发现卷柏总黄酮[27]、人参皂苷Rg1[28]、咖啡酸苯乙酯[29]等多种化合物均可能通过抑制ERS发挥DOX心脏毒性保护作用,其具体机制有待进一步阐明。

5 有抑制ERS作用的心脏保护药物

临床药物中,他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂、β受体阻滞剂、磷酸二酯酶-5抑制剂等药物均可能通过不同机制发挥DOX心脏毒性保护作用[30]。沙库巴曲缬沙坦是目前治疗射血分数降低性心力衰竭的新型药物。一项临床回顾性研究[31]中发现,沙库巴曲缬沙坦可改善癌症治疗相关心功能不全患者的超声心动图参数及临床症状。最近发现沙库巴曲缬沙坦可改善DOX处理小鼠心脏收缩功能及心肌细胞凋亡,下调凋亡相关蛋白Bax和caspase-3,以及ERS相关的蛋白GRP78、PERK、IRE1α、ATF6、eIF2α、ATF4和CHOP的表达水平[32],提示沙库巴曲缬沙坦的抗凋亡作用及心脏保护作用可能与调节ERS有关。此前有相关研究发现,利尿钠肽可通过抑制ERS来保护正常组织细胞,沙库巴曲可抑制利尿钠肽降解,从而提高利尿钠肽水平。替米沙坦可抑制ERS,缬沙坦作为同类药物,有无抑制ERS作用有待研究。此外,该项研究中沙库巴曲缬沙坦未证实其抗凋亡作用与抑制ERS之间的因果关系,该药心脏保护作用确切,同时心功能不全是DOX心脏毒性的主要临床表现之一,其DOX心脏毒性保护作用机制亟需进一步阐明。达格列净为钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂,可减少主要不良心血管事件(包括心力衰竭住院)和降低心血管死亡率,体外试验可降低GRP78、PERK、eIF2α、ATF4和CHOP水平以及改善DOX所致心肌凋亡,提示心脏保护作用可能与抑制ERS有关[33]。比索洛尔和培哚普利是心血管内科常用抗心力衰竭药物,具有一定心脏保护作用,大鼠DOX心脏毒性模型中,两种药均可降低GRP78、CHOP、JNK和caspase-12等ERS相关蛋白水平,提示比索洛尔和培哚普利可抑制ERS,且两种药物联合效果更强[34]。

研究表明,一些中药及其制剂对DOX所致心脏毒性有一定保护作用,最近发现,黄芪注射液可抑制DOX损伤所诱导的心肌细胞ERS,该作用可能是抑制CHOP凋亡途径以及通过网腔钙结合蛋白介导的[35-36]。富参颗粒可抑制DOX诱导的心力衰竭心肌细胞凋亡,CHOP和GRP78蛋白表达水平明显降低,表明富参颗粒可能通过抑制ERS,从而减少了心肌细胞凋亡,最终达到治疗心力衰竭的目的[37]。

6 小结

本文阐释了DOX心脏毒性中ERS相关机制,ERS作为细胞内错误折叠蛋白及未折叠蛋白所触发的一种应激反应方式,会触发UPR以纠正细胞内蛋白稳态失衡,如未纠正则UPR会长期激活,通过IRE1α/ASK1、CHOP等信号通路介导凋亡,从而损伤正常细胞及组织器官。

同时本文对具有心脏保护作用的化合物及临床药物中存在抑制ERS的药物进行综述。化合物相关实验多提示可抑制ERS,同时具有保护心脏作用,需进一步明确二者因果关系。有些化合物在DOX心脏毒性及ERS中研究较少,临床药物相关试验缺乏大规模临床试验,但这仍为研究者提供了新的科研思路及诊疗方法。需进一步阐明ERS在DOX以及蒽环类药物心脏毒性中的作用,探索可能以该机制为靶点的化合物及药物的保护机制及作用,尤其探索相关保护药物及化合物在不同实验模型、预处理时间及给药剂量、不同DOX及蒽环类药物间其心脏保护作用的区别。