隐丹参酮对肝癌细胞凋亡的影响及其机制

张海霞 李康康 程明阳 陈雪红

(1 青岛大学基础医学院医学药理学系,山东 青岛 266071;2 淄博市第一医院药品调剂科)

肝细胞癌是世界范围内常见的恶性肿瘤［1］,早期阶段可以通过手术治疗,但预后不好,易转移和复发。约有80%的患者确诊时已是中晚期［2］,错过有效的手术时机,通常只能使用药物进行治疗［3］。虽然临床可用的化疗药物可显著改善肝细胞癌患者的预后,但毒副作用较大,还易产生药物耐受［4］,因此临床迫切需要寻找更为安全有效的药物对肝癌患者进行治疗。

近年来,多种植物来源的天然化合物被开发用于肿瘤治疗,且表现出高效低毒的特性［5］。隐丹参酮(CPT)是从中药丹参中提取出的一种橙色针状结晶的天然活性化合物,易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂,微溶于水。具有抗炎、抗肿瘤和抗氧化等作用,被广泛用于心血管系统疾病、癌症等多种疾病的治疗［6-8］。研究发现,CPT可有效抑制肺癌、乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤的发展［9-11］,其还可以有效诱导肝癌细胞凋亡［12］,但目前关于CPT是否可以调节肿瘤细胞的自噬尚不清楚。本研究通过检测不同浓度的CPT处理HepG2细胞以后,对细胞活性、迁移能力以及细胞凋亡率的影响,以及加入自噬抑制剂Spautin-1后,HepG2细胞凋亡情况的变化,探讨CPT对HepG2细胞凋亡的作用及其机制,旨在为CPT应用于肝癌治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

MTT试剂盒、JC-1试剂盒以及FITC Annexin V-PI流式凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);PMSF、彩色预染Marker、ECL化学发光液(上海雅酶生物医药科技有限公司);CPT、Spautin-1(上海麦克林生化科技股份有限公司);LC3B-Ⅱ和β肌动蛋白(β-ACTIN)抗体和辣根过氧化物酶标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 MTT实验检测CPT对HepG2细胞增殖能力的影响

HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司,培养于含体积分数0.10胎牛血清(武汉普诺赛生命科技有限公司)和体积分数0.01青霉素-链霉素溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司)的培养液中,置于37 ℃、含体积分数0.05的CO2的恒温培养箱中培养。CPT和Spautin-1均先使用二甲基亚砜(DMSO)溶解配成母液,然后使用无血清培养基配制成实验所需的各种浓度。将处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板之中,培养24 h。吸出原培养液以后,分别加入浓度为0、1、5、10、20、40、100 μmol/L的CPT培养液100 μL,继续培养48 h。吸出原培养液,加入100 μL的MTT溶液,再孵育4 h。吸出MTT溶液,加入100 μL DMSO,摇床振荡5 min,以酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)测定波长490 nm处的吸光度值。计算细胞活性和半数致死浓度(IC50)值。以IC50值为依据,选择后续实验的CPT浓度。

1.3 划痕实验检测CPT对HepG2细胞迁移能力的影响

将对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板中,待细胞密度大于90%时,使用200 μL枪头对板底部细胞进行划痕,PBS洗2次,于培养基中分别加入浓度为0、1、5、10 μmol/L的CPT培养液100 μL(A～D组),继续培养48 h。倒置光学显微镜下(日本尼康株式会社)观察、拍照,记录划痕愈合情况并计算迁移率。

1.4 JC-1染色检测CPT对HepG2细胞线粒体膜电位的影响

将对数生长期的HepG2细胞接种于6孔板中,取培养48 h的A～D组细胞,吸去上层培养液,然后加入JC-1工作液,室温下避光孵育30 min,PBS清洗3次。荧光显微镜(德国徕卡仪器有限公司)下观察、拍照。计算绿色荧光与红色荧光比值,该比值越大,表示线粒体膜电位越低。

1.5 流式细胞术检测CPT对HepG2细胞凋亡的影响

取培养24 h的A、B、C、D组细胞,置于离心管中,以800 r/min离心5 min,PBS缓冲液重悬,再以800 r/min离心5 min,弃上清液,每管加300 μL上样缓冲液重悬后,分别加入5 μL FITC Annexin V和10 μL PI染色液。使用流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)分析HepG2细胞的凋亡情况,计算细胞凋亡率。

1.6 MTT实验检测联用自噬抑制剂Spautin-1和CPT对HepG2细胞增殖能力的影响

将对数生长的HepG2细胞接种于96孔板中,设置为E～H组,分别加入含0 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1、1 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1、5 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1以及10 μmol/L CPT+20 μmol/L Spautin-1的无血清培养液,继续培养48 h后,采用MTT实验检测各组HepG2细胞活性。

1.7 Western blot方法检测Spautin-1以及CPT对HepG2细胞LC3B-Ⅱ蛋白表达的影响

取培养48 h的A、D、H组细胞,裂解细胞,收集细胞悬液。12 000 r/min离心30 min,分离上清液,-80 ℃冰箱保存备用。采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度后。然后使用PAGE凝胶快速制备试剂盒制备SDS-PAGE凝胶,每孔上样10～20 μL样品后,80 V电泳20 min,120 V电泳60～80 min。随后300 mA转膜90 min,BSA封闭液封闭1 h,一抗4 ℃下孵育12 h,二抗室温孵育2 h后,ECL显影,显影仪(法国VILBER LOURMAT公司)下拍照,Image J对条带进行量化。

1.8 JC-1染色检测Spautin-1和CPT对HepG2细胞线粒体膜电位的影响

取培养48 h的A、D、E、H组细胞,按1.4方法对各组细胞染色,计算绿色荧光与红色荧光比值。

1.9 流式细胞术检测Spautin-1和CPT对HepG2细胞凋亡的影响

取培养24 h的A、D、E、H组细胞,按1.5方法分析各组细胞的凋亡率。

2 结 果

2.1 CPT对HepG2细胞细胞活性的影响

0、1、5、10、20、40、100 μmol/L浓度的CPT处理48 h时,HepG2细胞的细胞活性分别为(100.3±1.2)%、(83.7±4.0)%、(46.1±4.4)%、(22.1±2.3)%、(20.5±3.8)%、(19.1±1.2)%、(16.1±2.1)%。各浓度比较差异具有显著性(F=377.50,P<0.05);随着CPT浓度的升高,HepG2细胞的细胞活性呈显著性下降(t=5.40～25.26,P<0.05)。通过计算CPT作用HepG2细胞48 h时的IC50值为3.9 μmol/L。根据MTT实验结果,采用0、1、5及10 μmol/L的CPT用于后续实验。

2.2 CPT对HepG2细胞迁移能力的影响

CPT作用于HepG2细胞48 h以后,A～D组细胞的迁移率分别为(54.51±3.15)%、(37.14±3.11)%、(22.45±2.98)%、(0.00±0.19)%,各组间比较,HepG2细胞的迁移率差异具有显著性(F=508.90,P<0.05),且随着CPT浓度的升高,抑制HepG2细胞迁移能力逐渐增强(t=5.96～29.63,P<0.05)。

2.3 CPT对HepG2细胞凋亡的影响

JC-1染色结果显示,A～D组HepG2细胞处理48 h时,绿色荧光与红色荧光比值分别为0.00±0.03、0.45±0.15、1.50±0.19、7.18±0.59,各组间比较差异有显著性(F=333.20,P<0.05),随着CPT浓度的升高,HepG2细胞中绿色荧光逐渐增强,绿色荧光与红色荧光的比值也逐渐升高(t=4.24～23.36,P<0.05)。

流式细胞术检测结果显示,A～D组HepG2细胞处理24 h时,HepG2细胞的凋亡率分别为(7.22±1.91)%、(16.85±3.40)%、(24.52±1.86)%、(30.22±2.96)%。各组间比较差异有显著意义(F=160.90,P<0.05),随着CPT浓度的升高,HepG2细胞的细胞凋亡率逐渐增高(t=7.30～18.15,P<0.05)。

2.4 联用自噬抑制剂Spautin-1和CPT对HepG2细胞毒性和细胞凋亡的影响

MTT检测结果显示,E～H组细胞处理48 h以后,细胞活性分别为(92.60±3.44)%、(86.84±2.28)%、(64.89±3.86)%、(45.04±2.92)%,各组间比较,细胞活性均具有显著性差异(F=231.15,P<0.05),E组与A组、F组与B组、G组与C组、H组与D组相比,细胞活性均增加(t=3.96～18.80,P<0.05)。Western blot实验的结果显示,A、D、H组LC3B-Ⅱ蛋白的相对表达量分别为100.21±15.36、319.56±33.89、192.36±22.58。3组细胞的LC3B-Ⅱ蛋白表达比较差异均有显著性(F=602.36,P<0.05),其中A组、H组与D组比较,HepG2细胞中LC3B-Ⅱ蛋白表达比较均具有显著差异(t=9.17、3.52,P<0.05)。

JC-1染色结果显示,A、D、E、H组HepG2细胞的绿色荧光与红色荧光比值分别为0.13±0.05、3.02±0.15、0.31±0.16、0.68±0.24,各组间比较差异有显著性(F=103.25,P<0.05),其中E组与A组比较,差异无显著性(P>0.05);E组、H组与D组比较有显著差异(t=3.58、14.76,P<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,A、D、E、H组HepG2细胞的凋亡率分别为8.51±2.44、29.99±2.39、10.42±1.15、20.35±2.72,各组间比较差异有显著性(F=221.69,P<0.05),其中E组与A组比较,该比值无显著差异(P>0.05),E组、H组与D组进行比较该比值均有显著差异(t=12.38、4.99,P<0.05)。

3 讨 论

丹参通常使用其干燥根入药,被用于治疗多种疾病,例如心脑血管病、肝病、血液系统疾病、出血、月经紊乱、流产和失眠等［13］。CPT作为丹参的主要二萜衍生物,在不同的疾病中均表现出了优异的药理活性,尤其在肿瘤的预防和治疗方面具有巨大潜力［14］。研究表明CPT对肺癌、白血病、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、神经瘤、膀胱癌等均具有抑制作用［15-16］,其作用机制主要包括抑制肿瘤细胞生长、转移、侵袭、血管生成、诱导凋亡、调节免疫、诱导细胞自噬等［16-17］。如CHEN等［14］研究发现,CPT可调节AMPK/TSC2/mTOR信号通路,并且通过上调AMPK刺激TSC2,进而抑制mTOR信号通路,达到抑制癌细胞增殖和生长的作用。

本研究发现,CPT能显著抑制HepG2细胞活性,48 h时的IC50值为3.9 μmol/L。细胞迁移是肝细胞癌侵袭转移的重要因素,CPT可以通过抑制MMP-2和MMP-9以及PI3K/Akt/mTOR信号通路,从两个方面干扰结肠癌细胞的迁移［18］。还有研究表明CPT通过下调PGE2诱导的β-连环蛋白表达和通过上调E-钙黏蛋白和GSK3-β表达抑制细胞迁移［19］。因此,针对CPT的抗迁移活性,本研究将梯度浓度的CPT处理HepG2细胞48 h,结果显示CPT以浓度依赖的方式抑制HepG2细胞迁移。研究发现,CPT可以通过抑制信号转导和转录激活因子3(STAT3)磷酸化,从而调节线粒体功能并抑制肿瘤的进展［20］。由此可以推测CPT可能会影响肿瘤细胞的线粒体功能。本研究JC-1染色实验结果显示,HepG2细胞经过CPT处理后绿色荧光与红色荧光比值降低,线粒体膜电位下降,功能失调,这可能是由于CPT抑制了STAT3活性,从而使线粒体功能失调。为进一步研究CPT的凋亡诱导作用,本研究又通过流式细胞术实验对不同浓度CPT处理24 h后凋亡细胞进行分析,结果显示CPT可以有效诱导HepG2细胞凋亡。

有研究显示CPT可通过激活肿瘤细胞自噬诱导细胞凋亡［21］。自噬是细胞物质被运送到溶酶体进行降解的过程,真核细胞利用自噬来调节细胞的生长和内部的稳态［22］。自噬是细胞应对应激环境的重要手段之一,其在癌症发展的不同阶段中发挥着两种完全相反的作用,即抑瘤和促瘤作用［23］。在癌症发展早期,自噬可以有效控制细胞的稳态,抑制肿瘤发生和发展［23］;但当癌症进展到晚期,由于肿瘤细胞生长过快,肿瘤内部严重缺乏营养物质和氧气等,在这种环境下自噬则成为了保护癌细胞存活的有效手段［23］。XU等［24］研究发现,CPT通过诱导ROS积累从而激活MAPK/NF/kB信号通路,诱导多药耐药人结肠癌细胞SW620的自噬和细胞死亡。基于此本研究通过CPT联用自噬抑制剂Spautin-1探讨了CPT是否是通过自噬诱导肝癌HepG2细胞凋亡的,MTT结果显示,Spautin-1的加入逆转了CPT对于HepG2细胞活性的抑制;同时Western blot实验结果显示Spautin-1可以显著降低CPT诱导的自噬关键蛋白LC3B-Ⅱ的表达。由此可以推测CPT是通过自噬抑制了HepG2细胞的增殖。LUO等［25］研究发现CPT是通过PI3K/AKT/mTOR途径诱导Huh7和MHCC97-H细胞的凋亡和自噬,进一步抑制其增殖。本课题组先前的研究也发现,CPT可以通过激活结直肠癌细胞HCT116内质网应激介导的自噬诱导细胞凋亡［21］。本研究中JC-1染色和流式凋亡实验结果显示,相比于单用CPT,联用自噬抑制剂Spautin-1后绿色荧光和红色荧光比值降低,凋亡细胞减少。提示CPT对HepG2细胞活性的抑制以及对凋亡的诱导作用,可能是通过诱导自噬实现的,这为CPT的研究拓展了思路。

综上,从临床常用的中药丹参中提取的天然化合物CPT,可以通过诱导HepG2细胞凋亡抑制其增殖和迁移,其作用机制可能是通过诱导自噬进而促进了细胞的凋亡。本研究为CPT应用于肝癌治疗提供了理论和实验支持。

作者声明：张海霞、李康康、程明阳、陈雪红参与了研究设计;张海霞、李康康、陈雪红参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文。所有作者均声明不存在利益冲突。