冷冻电镜平台3＋X运行模式的探索与思考

吴航军，韩 琴，肖桂凤，林赵肖楠，戎 叶

（1.浙江大学医学院，杭州 310058；2.杭州师范大学基础医学院，杭州 311121）

0 引 言

1931 年，德国科学家Max Knoll 和Ernst Ruska 发明了世界上第一台透射电子显微镜，使人们可以观察到超显微细胞结构，发现了各种重要的细胞器。然而，利用传统电子显微镜观察生物样本存在明显的技术瓶颈：①电镜的高真空环境难以维持生物样本的水环境；②高能电子辐射会损伤生物样本；③生物样本需要进行重金属染色后成像，难以获得高分辨结构图像。为了解决这些瓶颈问题，以瑞士洛桑大学的Jacques Dubochet教授、美国哥伦比亚大学的Joachim Frank 教授和英国剑桥MRC 分子生物学实验室的Richard Henderson教授为代表的科学家在样本制备方法、图像三维重构技术和数据收集相机等方面做出开创性工作，为实现冷冻电镜技术（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）奠定了坚实基础，让冷冻电镜成为解析生物大分子结构的利器，他们3 人因此共同获得了2017 年诺贝尔化学奖。经过多年的发展，冷冻电镜技术已与X 射线晶体学（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）成为结构生物学研究的三大主流技术。相比其他技术，冷冻电镜技术优势显著：无须结晶、样本接近天然状态、所需样本量极少、适用广泛。近十多年来，冷冻电镜技术已成功解析了众多其他技术手段难以解析的重要生物大分子复合物，包括剪切体［1-3］、离子通道［4-11］、线粒体呼吸链超复合体［12］、光系统超复合体［13-15］、藻胆体［16］、G 蛋白偶联受体（GPCR）［17-22］和新冠病毒相关蛋白结构［23-30］等。

中国生物电镜技术研究起始于20 世纪80 年代，随后在90 年代开启了国内冷冻电镜技术研究新篇章。2008 年，清华大学购置了亚洲第1 台300 kV 冷冻电镜Titan Krios，建立了国内第一个冷冻电镜平台，随后中国科学院生物物理所和国家蛋白质中心（上海）也分别组建了冷冻电镜平台。浙江大学历时4 年于2017 年5 月成功建立了国内第4 个、浙江省第1 个冷冻电镜平台。

以2017 年诺贝尔化学奖的授予和冷冻电镜技术在多个领域的应用发展为契机，国内各大高校、科研院所掀起了冷冻电镜平台建设的热潮。截至2022 年5月，国内已有15 个省市34 家单位建成冷冻电镜平台，已安装或购置的300 kV 冷冻电镜共有69 台（见图1），近半数分布在北京和上海，全球范围内300 kV 冷冻电镜的数量已经超过400 台。自2014 年起，国内不断涌现出利用冷冻电镜技术获得的突破性成果，截至2022 年5 月，累计发表在Cell、Nature、Science 期刊上的高水平论文近150 篇。自2019 年以来国内大部分冷冻电镜平台均已成熟稳定运行，每年支撑的高水平论文约占全球20%（见图2），居世界前列水平，这得益于近些年我国在冷冻电镜平台设施建设的大力投入以及我国科研工作者研究水平的大幅提升。浙江大学冷冻电镜中心配备了1 台300 kV 冷冻电镜，2019 年至今，累计支撑发表了13 篇Cell、Nature、Science 期刊论文，充分体现了中心支撑高水平科研成果的高效性。

图1 国内300 kV冷冻电镜分布

图2 自2010年以来利用冷冻电镜发表CNS文章国内外分布情况

1 冷冻电镜平台的建设

2013 年，我校开始筹建冷冻电镜中心，相关人员先后赴清华大学、中科院生物物理所和国家蛋白质中心（上海）等地调研学习冷冻电镜平台建设和运行的经验，经过近4 年的筹措组建，配备了300 kV 冷冻电镜的冷冻电镜中心于2017 年5 月正式运行。冷冻电镜中心（以下简称中心）旨在建成基于冷冻电镜技术、常规生物电镜技术、三维大尺度扫描电镜技术和光电关联显微镜技术的跨尺度高端生物电镜中心，为结构生物学、细胞生物学、神经生物学和材料学等学科研究提供技术服务，具体仪器架构如图3 所示。中心组建了学术委员会、教授管理委员会和技术团队：学术委员会由国内电镜领域知名专家组成，对中心的中、长期发展规划提出咨询和审议意见；教授管理委员会由校内多个学院电镜相关的专家或用户组成，对中心日常运行的重大事项进行审议决策；技术团队由浙江大学求是特聘教授和浙江大学求是讲座教授领衔、13 名技术人员组成（博士4 名、硕士9 名，其中事业编制6 人，项目聘用6 人，退休返聘1 人），分别负责冷冻电镜技术、细胞／组织结构分析技术（常规及免疫电镜、电子断层成像、光电关联）、临床辅助诊断技术和仪器维护与技术开发。

图3 冷冻电镜中心仪器架构

2 探索3＋X创新运行模式

冷冻电镜中心的建设和运行需有充足的经费持续性支撑，一个完备的冷冻电镜中心初期建设经费需近1 亿元，规模较大的则超过2 亿元，日常运行、设备的耗材更换以及后期维保费用，是冷冻电镜中心运行的主要支出，如若没有源源不断的经费注入，将会给中心运行带来巨大的压力，这也是国内外冷冻电镜平台面临的最主要问题之一。中心自建成运行以来，积极探索创新运行模式，在确保提供高质量技术服务的前提下，大力扩展业务，力求实现收支平衡。

2.1 3＋X技术支撑体系

中心成立后，力求以夯实冷冻电镜、常规电镜和大尺度扫描电镜三大技术作为对外服务的根基，积极探索开发并完善各项技术的应用领域，逐步形成3＋X的技术服务体系。

（1）免疫电镜技术的完善和应用。免疫电镜技术是透射电镜技术重要的补充，可对蛋白质实现精确定位，是生物电镜技术中难度较大的一类，其难度在于保持抗原活性同时还需保证良好的细胞超微结构，中心经过多年的探索和完善，现该技术已成熟应用在生命科学领域多个学科的蛋白定位。

（2）光电关联技术的建立。光电关联是一种光学显微镜结合电子显微镜开展研究的技术体系，电子显微成像技术在成像特点、分辨率及应用范围等方面与光学显微成像技术存在很大的互补性。通过技术关联弥补各自短板、突破单一技术的限制，获得更多的样本信息［31］。因此，在同一样本的分析中结合两种或多种成像技术的模式使用越来越普遍。针对不同样品或实验条件，中心不断孵化新型光电关联技术，实现在细胞、组织和冷冻等条件下实施关联技术，现已初步建成光电关联技术体系。

（3）发展电镜临床辅助诊断技术。相比常规病理科诊断所用的荧光显微镜，电镜在分辨率上有极大的优势，为充分发挥医院医疗资源优势和冷冻电镜中心设备与技术资源优势，2018 年浙大冷冻电镜中心联合浙江大学医学院附属邵逸夫医院签署合作框架协议，设立“电镜诊断研究中心”，在临床科研和临床诊断等方面开展全面的合作，同年与浙江省人民医院生殖科签订合作协议，共同探索电镜技术在生殖健康研究和临床辅助诊断方面的应用。此外，冷冻电镜中心也与多家医院达成合作，将电镜技术应用在肾病、口腔疾病、血液病及神经系统疾病等领域的临床辅助诊断，扩展电镜技术应用的同时，也更好地将高校仪器设备服务于社会。

（4）冷冻电镜技术应用的拓展。冷冻电镜技术能瞬间将样品固定在接近天然的状态下，是研究样品天然状态的最佳技术之一，除了应用在生命科学领域的结构与功能研究，在药物结构、新能源材料、生物高分子等辐射敏感材料的高分辨成像也能受益于冷冻电镜技术的应用。

2.2 开放服务模式

为了确保中心有序运行，向用户提供最优质高效的技术服务，中心尝试完善对外开放模式，并不断探索新的运行模式。

（1）信息化平台搭建用户与中心的桥梁。以中心网站和公众号为主体，实现信息化管理，集合信息发布、培训讲座、仪器预约与管理、数据传输、门禁关联和监控等功能，提升用户与中心的交互性，实现中心管理集约化、运行高效能。

（2）加强教学培训实行分类管理。教学方面，为研究生开设《研究生科研技能》课程，通过理论和上机实操讲授电子显微镜技术、冷冻电镜技术和科研图片的获取与处理等课程及上机实操，稳固研究生的实验技术基础；培训方面，针对各类仪器，定期开展小班培训，提高学生的仪器操作能力，经过初级培训的用户可以获得普通资格，能预约工作时间段的仪器；对于已熟练掌握仪器理论知识及仪器操作能力的学生，经考核通过后获得资深资格，可预约任意时间段，不受非工作时间限制，且仪器使用费大幅优惠。通过预约权限导向和收费标准导向，对用户进行适度分流，避免工作时间段的拥挤，并有效提升仪器非工作时间利用率，实现仪器开放最大化。自运行以来，累计受益学生超1 200人次。

（3）技术传承与技术人才培养。中心每年为校内勤工俭学的学生设立多个助管岗位，为学生减轻经济负担，也让学生在实践中得到历练、获得实验技能，为后续深造或工作提供帮助；中心与河南化工技师学院建立长期合作关系，作为实习基地，对口培养电子显微镜技术专业的学生，为中心和国内其他兄弟单位输送电镜技术人才；中心也为国内兄弟院校的技术人员提供了技术培训服务。拥有熟练实验技能的助管或实习生，均可作为中心技术队伍的一部分，为用户提供优质的技术服务。

（4）适度保障应急需求。部分使用率较高的仪器无法在工作时间满足测试需求，对于只有普通资格且有紧急使用需求（如文章修回补实验等）的用户，中心不断摸索新的工作模式，鼓励工作人员在非工作时间加急完成测试服务，并为其提供调休或加班津贴，该模式仍在摸索阶段，将在实践中不断完善。

3 运行成效

3.1 创新模式下运行效率大幅提升

在“3＋X”运行模式下，中心对外服务量及机时逐年增长，服务范围涵盖校内外科研、临床诊断、制药等领域。截至2021 年12 月，已经为校内500 多个课题组和250 多个校外单位提供了高水平的科研技术服务，对外服务机时累计424 623 h，用户服务评测满意率超95%。中心的业务不断拓展，范围覆盖校内、国内高校和科研院所、医院、企业，用户来自生命、医药、农学、材料、化学、能源、环境、临床等学科。2018～2021 年，中心仪器平均校外机时占25.6%，校外测试收入占37.4%。此外，通过业务拓展和优化管理，一部分使用率低的老旧设备使用效率得到了极大提升，2000 年购置的100 kV透射电子显微镜，在2017 年纳入中心管理后，拓展电镜临床辅助诊断技术应用，扩大对外服务，运行效率大幅提升，服务机时数和样本量攀升了3 倍。测试收入大幅提升，为中心的运行提供了有力的保障（见图4）。中心运行收入主要来自对外测试服务（占76.3%）、学校补贴（占13.2%）和共建单位支持（占10.4%），主要支出包括设备维保与维修（55.1%）、人员费（占29.9%）和试剂耗材及办公（占15.0%）等，至2021 年，中心已经基本实现收支平衡，实现良性循环。

图4 单台透射电子显微镜运行效率大幅提升

3.2 服务成效显著

冷冻电镜中心的运行，为学校的发展提供了重要的支撑作用：吸引了包括海外优青、浙江省千人、浙大百人等19 人加盟；2017 年成立以来支撑发表高水平论文超过50 篇，其中Science、Nature 和Cell 论文13篇，支撑获得多个奖项，包括2019 年全国十大科学进展1 项、2021 年中国科技十大突破1 项，浙江大学2021 年度突出学术贡献奖1 项、浙江大学2021 年度十大科学进展2 项；成立以结构生物学为重点的生物物理学系，与临床医学、基础医学、生物学、农学等学科展开广泛的交叉合作。

3.3 助力获得突破性成果

中心技术团队不断发展新技术、改进现有技术条件，突破技术瓶颈、解决技术难题、提升设备效率，提高技术支撑水平，通过中心的技术支持，在医学、结构生物学、神经科学、植物学等多个领域取得了突破性进展，包括人源甲状旁腺激素受体结构与动力学研究［32］、抗癫痫、高血压药物靶点解析［33］、瑞德西韦抗新型冠状病毒基础药理研究［34］、古老绿硫细菌光合作用反应中心解析［14］、GPCR 激活以及配体识别的结构解析［35］、细菌鞭毛马达结构、组装与扭矩传输机制研究［36］、大麦叶绿体光系统超大复合物三维结构解析［15］、昆虫纳米分辨率完整三维结构重建［37］等。

4 面临的问题

（1）仪器和技术的更新。结构生物学领域研究竞争激烈，很大程度上依赖于冷冻电镜的性能和前沿的冷冻电镜技术。随着冷冻电镜技术的发展，电镜光源、直接电子探测器、能量过滤器等硬件性能的提升，冷冻电镜技术得到了进一步突破，可以实现接约0.1 nm（1 Å）的近原子分辨率［38］，新的冷冻电镜将会助力解决更多生命科学及其他领域的问题；随着冷冻电子断层扫描技术（cryo-electron tomography，Cry-ET）的成熟，基于原位结构解析的冷冻电镜技术将在生命科学领域发挥更重要的作用；电镜领域大部分仪器设备国产率低，特别是冷冻电镜主体、直接电子探测器和数据收集及分析软件均依赖进口，主要由美国的Thermo Fisher和Gatan公司垄断。电镜样品制备相关的部分设备已经实现国产化或者在研制中，相信在未来，国产化的比例将会越来越高。

（2）运行和发展的压力。冷冻电镜技术在国内普及已有近5 年时间，随着冷冻电镜技术的发展，前期配置的冷冻电镜的硬件性能已落后于主流型号，仪器零部件故障率大幅增加，仪器的维修维护以及迭代更新，都需要大量、持续的经费投入，这对于国内大部分冷冻电镜平台的运行将会有较大的压力。除了提高自我造血能力、维持收支平衡、确保良性运行，新型冷冻电镜等仪器的购置仍需学校、社会和国家层面的大力支持。

（3）技术支撑队伍的稳定与发展。国内已建成超过30 个冷冻电镜平台，部分在企业，然而，因对技术人员专业要求高、培养周期长等因素导致人才一直紧缺。同时受编制、待遇和职业发展等因素影响，不少技术人员仍缺乏归属感和稳定性，中心培养的技术人员不断流失，已有6 人先后离职，这对中心的技术服务和长远发展极其不利。

5 结 语

高校和科研院所冷冻电镜中心的建成和运行，让多个学科收益颇丰，在相关领域的结构和功能研究上取得了一系列具有国际影响力的突破性成果，并将持续产出。技术发展上，冷冻电镜技术将向更高分辨率发起冲击，实现接近0.1 nm 超高分辨率结构解析能力，解决诸如药物设计、新能源材料、无机高分子材料和纳米光子学等领域的瓶颈问题，促进多学科交叉会聚，实现从0～1 的突破；以冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）为主体的原位结构生物技术将会逐步得到完善和应用，实现在细胞和组织原位解析生物大分子复合物的高分辨三维结构，揭示物质的结构与功能关系。平台运行方面，探索冷冻电镜平台收支平衡的运行模式至关重要，建立完善的电镜技术体系，实现自我造血；人才队伍建设方面，加强人才队伍建设，完善晋升和绩效考核机制，切实提高技术人员待遇，提升技术人员的归属感，设立实验技术研究专项基金，有助于平台技术体系的完善和服务水平的提高；建立一支稳定、高水平的技术队伍，引育高层次技术人才，以技术提升和高水平服务为导向，实现从仪器操作到功能开发的转变，从服务科研到引领科研的转变，体现技术人才的价值。此外，冷冻电镜相关设备主要依赖进口，需要国内相关专家共同努力，重点研制冷冻电镜关键部件，早日实现自主研发生产，解决这一领域的“卡脖子”问题。