外源NO对马铃薯块茎创伤木栓化过程中内源激素的影响

田 登,马 露,杨 芳

(云南农业大学农学与生物技术学院,昆明 650201)

【研究意义】马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属一年生草本植物,对环境的适应能力比较强,在世界各地均有广泛种植,是世界第三大粮食作物[1]。中国马铃薯生产潜力巨大,优势明显,产业前景广阔,是世界上最大的马铃薯生产国,产量约占世界总产量的1/4,被誉为 21 世纪最有发展前景的高产经济作物之一[2]。云南省是全国马铃薯的主产区之一[3]。马铃薯粮菜兼用,产量高,营养丰富,产品附加值高,国内种植面积及产量皆居世界首位,是中国重要的粮食安全作物[4]。但是马铃薯块茎在采收、分级、包装和运输过程中易受不同程度的碰伤、擦伤和切伤等机械损伤[5]。因此,研究马铃薯创伤块茎快速愈合的方法具有现实意义。【前人研究进展】木栓质是一种具有脂肪族和芳香族结构域的细胞壁生物聚合物,在植物的伤口组织中合成,以限制水分流失和病原体感染[6]。一氧化氮(NO)作为主要的气态信号分子,可参与从种子萌发到根系发育再到幼苗生长的一系列植物生理过程,并参与植物对非生物胁迫的响应,包括干旱胁迫、低温胁迫、热胁迫、高盐胁迫、臭氧胁迫和重金属胁迫[7]。Efetova等[8]研究证实在农杆菌诱导的肿瘤中,ABA与水通道蛋白基因的表达相关,并能增加拟南芥根组织中木质素的含量。Lulai等[9]研究认为创伤诱导导致活性细胞分裂素短暂滞留,并且生长素会相应增加,表明这些激素参与了伤口周皮发育的诱导。Zhang等[10]研究证实茉莉酸(JA)可以促进拟南芥叶片外植体伤口新根再生反应。杨芳等[11]研究认为马铃薯块茎创伤后创伤木栓化及创伤周皮的形成,与ABA、ZR和GA等内源激素协同调控及POD、PAL酶活增加有关。【本研究切入点】马铃薯在采收期极易受到机械损伤,且影响其愈合的因素有很多。目前对外源NO促使马铃薯块茎创伤愈合过程中与内源激素之间关联的研究较少。【拟解决的关键问题】通过使用SNP(NO供体)和C-PTIO(NO清除剂)处理样品材料,研究外源NO对马铃薯块茎创伤后不同时间内源激素变化,探讨外源NO在马铃薯块茎创伤愈合中对内源激素作用机制,为探索加快马铃薯块茎创伤愈合的方法提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用的马铃薯为云南农业大学薯类作物研究所提供的马铃薯品种‘滇薯47’(以D47表示)。采收后挑选薯皮完整、无病虫害、大小形态类似的马铃薯块茎。于常温下放置14 d后避光储存在5 ℃条件下的冷库内。试验前从仓库取出,放置在常温下平衡2 d后进行后续试验。

本试验采用硝普酸钠(SNP, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)为NO供体,在水溶液溶解时就可释放NO;以2-(4-羧基苯基)-4,4,5,5,-四甲基-1,3-二氧咪唑啉钾盐(C-PTIO, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)为NO专用清除剂,其广泛用于消除植物中NO的累积。

1.2 试验方法

马铃薯块茎创伤处理参考张梅花等[12]的方法,用打孔器和刀片将去除表皮的马铃薯块茎处理为直径约15 mm、厚度约5 mm、重1 g左右的小圆片,将小圆片根据测定用量分成3份,用纯水冲洗去除表面的淀粉粒。试验设3次处理,每个处理3次重复,CK处理:超纯水;SNP处理:0.5 mmol/L SNP溶液;C-PTIO处理:1.3 mmol/L C-PTIO溶液。上述小圆片放入各处理溶液中(<30片/100 mL处理液)。将3份材料分别置于100 mL烧杯中在旋转震荡器(80 r/min)上温育1 h,并且每隔20 min更换一次处理液。处理完成后放置于底部覆盖有保鲜薄膜且垫有滤纸并贴上标签的磁盘上,置于(23±1)℃、空气相对湿度85%、光照为0的培养箱进行创伤愈合反应。

分别于处理后0、27、46、54、72 h取样,每个处理各3次重复,每个重复取1个圆片,用液氮冷冻干燥并放置于-80 ℃的冰箱中保存,用于测定内源激素含量。

1.3 内源激素含量测定

1.3.1 标准曲线建立 用甲醇水溶液将标准品稀释为一系列浓度梯度的标准曲线溶液,用同位素内标法建立标准曲线。

1.3.2 代谢物提取 用液氮研磨样品并取100 mg样品置于2 mL的离心管中,加入30 μL内标溶液和1 mL乙腈水溶液(1%FA),震荡2 min使其混匀;在4 ℃并且避光的环境中,抽提12 h,离心20 min,吸取上清液,用氮气吹干后再用100 μL乙腈水(1∶1,v/v)复溶,再离心20 min后,取上清液分析。

1.3.3 色谱-质谱分析 采用Waters I-Class LC超高效液相色谱系统对提取的样品进行分离。色谱柱为:柱Waters, ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column;流动相:A液为0.05%FA水溶液,B液为0.05%FA乙腈。将样品放置在自动进样器为4 ℃,柱温45 ℃,流速为400 μL/min,进样量2 μL中。相关液相梯度如下:0～10 min,B液从2%线性变化到98%;10.0～10.1 min,B液从98%线性变化至2%;11～13 min,B液维持在2%。在样本队列中,每间隔一定数量的试验样本设置1个QC样本,用于检测和评价系统的稳定性及重复性。

使用5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX)在正/负离子模式下进行质谱分析。5500 QTRAP ESI源条件如下:源温 500 ℃, 气体放电离子源1(Gas1):45, 气体放电离子源2 (Gas2):45, 帘气(CUR):30, 离子喷雾电压-4500 V;采用MRM模式检测待测离子对。

1.4 试验数据与统计分析

文中显示数据均为平均值,数据采用IBM SPSS Statistics 25 软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 外源NO处理对脱落酸(ABA)含量的影响

由图1可知,CK处理中,随时间的延长总体呈下降趋势,0 h时为97.35 ng/(g·FW),72 h为43.82 ng/(g·FW);SNP处理的ABA含量随时间的延长呈先下降后上升趋势,27 h时最低,为39.71 ng/(g·FW);C-PTIO处理的ABA含量随时间的延长总体呈下降趋势,72 h时最低,为26.51 ng/(g·FW)。在27 h时,CK处理的ABA含量比SNP处理和C-PTIO处理分别提高19.91%、25.88%,SNP处理和C-PTIO间无显著差异(P>0.05,下同);46 h时,SNP处理的ABA含量比C-PTIO处理 提高35.81%,SNP处理和CK处理间ABA含量无显著差异;54 h时,SNP处理的ABA含量比CK处理和C-PTIO处理 分别提高58.22%、65.73%,CK处理和C-PTIO处理间无显著差异;72 h时SNP处理比CK处理和C-PTIO处理分别提高52.83%、71.46%,CK处理比C-PTIO处理提高39.51%,三者间差异显著(P<0.05,下同)。与CK处理相比,SNP处理在一定程度上显著提高马铃薯块茎愈伤木栓化过程中的内源ABA含量,而C-PTIO处理在一定程度上降低马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源ABA含量。

不同小写字母表示同一处理在不同时间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示同一时间不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Different lowercase letters represent the difference significance in the same treatment at different times. Different uppercase letters represent the difference significance in different treatments at the same time. The same as below.图1 不同处理ABA含量变化Fig.1 Changes of ABA content under different treatments

2.2 外源NO处理对乙烯前体ACC含量的影响

由图2可知,CK处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源ACC的含量随时间延长呈先下降后上升趋势,46 h时最低,为22.78 ng/(g·FW);SNP处理随时间延长呈先下降后上升趋势,27 h最低,为20.23 ng/(g·FW);C-PTIO处理随时间延长总体呈下降趋势,54 h时最低,为20.73 ng/(g·FW)。0、27和46 h时,3个处理间ACC含量无显著差异;54和72 h时,SNP处理 ACC含量比CK处理分别提高22.58%、26.82%,比C-PTIO处理分别提高30.68%、35.72%,CK处理和C-PTIO处理间ACC含量无显著差异。与CK处理相比,SNP处理促进了马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源ACC含量的增加,而C-PTIO处理抑制马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源ACC含量的增加。

图2 不同处理ACC含量变化Fig.2 Changes of ACC content under different treatments

2.3 外源NO对水杨酸(SA)含量的影响

由图3可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中3个处理中内源SA的含量随时间延长,呈先上升后下降再上升的趋势,27 h时为第1个峰值,CK处理、SNP处理、C-PTIO处理分别为391.31、448.86、423.96 ng/(g·FW);SNP处理在46 h时为波谷,为378.85 ng/(g·FW),CK处理和C-PTIO处理在54 h时为波谷,分别为356.35、295.12 ng/(g·FW);在72 h时,3个处理为第2个峰值,分别为517.50、574.90、467.04 ng/(g·FW)。27 和46 h时,3个处理间SA含量无显著差异;54和72 h时,SNP处理的SA含量比CK处理分别提高22.29%、9.98%,比C-PTIO处理分别提高35.64%、18.76%;54 h时,CK处理和C-PTIO处理间SA含量差异不显著;72 h时,CK处理 的SA含量比C-PTIO处理显著提高9.75%。表明,与CK处理相比,SNP处理在一定程度上会促进马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源SA含量的增加,而C-PTIO处理则在一定程度上抑制了马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源SA的积累。

图3 不同处理SA含量变化Fig.3 Changes of SA content under different treatments

2.4 外源NO对吲哚乙酸(IAA)含量的影响

由图4可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中3个处理中内源IAA的含量随时间延长总体呈上升趋势,27 h内上升最快,27 h后上升趋缓;SNP处理与C-PTIO处理变化趋势相同,均为有2个波峰,SNP处理在54 h时最高,为186.62 ng/(g·FW);C-PTIO处理在27 h时最高,为89.16 ng/(g·FW)。在27、46和54 h时,SNP处理比CK处理分别提高42.87%、36.33%、50.57%,比C-PTIO处理分别提高42.28%、58.81%、52.25%,CK处理和C-PTIO处理间IAA含量差异不显著;在72 h时,CK处理和SNP处理 的IAA含量比C-PTIO处理分别提高26.90%、34.22%,且CK处理和SNP处理间IAA含量差异不显著。表明,与对照CK相比,SNP处理可一定程度上促进马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源IAA含量的增加,C-PTIO处理会降低马铃薯块茎愈伤木栓化过程中的内源IAA含量。

图4 不同处理IAA含量变化Fig.4 Changes of IAA content under different treatments

2.5 外源NO对茉莉素类含量的影响

由图5可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中3个处理中内源JA含量在CK处理和C-PTIO处理中随时间的延长总体呈先上升后下降趋势,27 h时最高,分别为23.88、45.21 ng/(g·FW);在27 h,C-PTIO处理的 JA含量比CK处理和SNP处理分别提高47.17%和87.61%,CK处理和SNP处理间差异不显著;在46～72 h,3个处理间JA含量差异不显著。表明,与对照相比,SNP处理可在一定程度上抑制马铃薯块茎愈伤木栓化过程中JA含量增加,C-PTIO处理可在一定程度上提高马铃薯块茎愈伤木栓化过程中的JA含量。

图5 不同处理JA含量变化Fig.5 Changes of JA content under different treatments

由图6可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源JA-ILE的含量在CK处理中呈先上升后下降,再上升趋势,27 h最高,为1.44 ng/(g·FW);SNP处理中呈先下降后上升趋势,46 h最低,为0.19 ng/(g·FW);C-PTIO处理呈先上升后下降趋势,27 h最高,为2.05 ng/(g·FW)。在27 h,CK处理和C-PTIO处理 JA-ILE含量比SNP处理分别提高73.82%和81.65%,CK处理和C-PTIO处理间JA-ILE含量差异不显著;46、54和72 h,3个处理间JA-ILE含量差异不显著。表明,与CK处理相比,前期处理NO对马铃薯块茎愈伤木栓化过程中JA-Ile含量的积累有促进作用,后期对其含量有抑制作用,在整个创伤愈合过程中,C-PTIO对JA-Ile含量增加起抑制作用。

图6 不同处理JA-Ile含量变化Fig.6 Changes of JA-Ile content under different treatments

由图7可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源 cis-OPDA的含量在CK处理和C-PTIO处理中,总体呈先上升后下降再上升趋势,27 h时最高,分别为35.92和34.17 ng/(g·FW);SNP处理中,呈先下降后上升趋势,27 h最低,为8.24 ng/(g·FW)。在27 h,CK处理和C-PTIO处理 的cis-OPDA含量比SNP处理分别提高77.06%和75.89%,CK处理和C-PTIO处理间 cis-OPDA含量差异不显著;46 h C-PTIO处理 cis-OPDA含量比CK处理和SNP处理分别提高16.73%和31.29%,CK处理和SNP处理间 cis-OPDA含量无显著差异,54和72 h,3个处理间 cis-OPDA含量差异不显著。表明,与CK处理相比,SNP处理对马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源cis-OPDA含量有一定的抑制作用,C-PTIO处理在块茎创伤愈合中期对内源cis-OPDA的积累有一定促进作用。

图7 不同处理cis-OPDA含量变化Fig.7 Changes of cis-OPDA content under different treatments

2.6 外源NO对细胞分裂素类含量的影响

分别对3个处理的细胞分裂素类物质反式玉米素(tZ)、顺式玉米素(cZ)、反式玉米素核苷(trans zeatin riboside, tzR)、顺式玉米素核苷(cis zeatin riboside, czR)、异戊烯基腺嘌呤(iP)和异戊烯基腺苷(iPA)的含量进行测定。由图8可知,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源tZ的含量随时间的延长3个处理均呈先上升后下降趋势,SNP处理在27 h最高,为3.39 ng/(g·FW),CK处理和C-PTIO处理在46 h时最高,分别为3.81、2.49 ng/(g·FW)。在27和72 h SNP处理的 tZ含量比CK处理分别提高21.38%、43.48%,比C-PTIO处理分别提高38.74%、48.43%,CK处理和C-PTIO处理间tZ含量差异不显著;46 h CK处理的 tZ含量比SNP处理和C-PTIO处理分别提高38.54%、34.45%,C-PTIO处理和SNP处理间tZ含量无显著差异,54和72 h,3个处理间tZ含量差异不显著。结果表明,与CK处理相比,SNP处理在马铃薯块茎创伤愈合的前期和后期对内源tZ含量的积累有明显促进作用,而在中期表现出抑制作用,而C-PTIO处理抑制内源tZ含量的积累。

图8 不同处理tZ含量变化Fig.8 Changes of tZ content under different treatments

由图9可知,CK处理和SNR处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源cZ含量随时间的延长均呈上升趋势,均是72 h最高,分别为1.63、1.40 ng/(g·FW),C-PTIO处理呈先上升后下降趋势,54 h最高,为1.23 ng/(g·FW)。在27～54 h,3个处理间cZ含量差异不显著;72 h时CK处理和SNP处理 的cZ含量比C-PTIO处理分别提高67.03%和61.44%,CK处理和SNP处理间cZ含量无显著差异。结果表明,与CK处理相比,SNP处理对马铃薯块茎愈伤木栓化过程中cZ含量没有明显影响,而C-PTIO对马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源cZ含量的积累有抑制作用。

图9 不同处理cZ含量变化Fig.9 Changes of cZ content under different treatments

由图10可知,CK处理和SNP处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源tzR的含量随时间延长均呈上升趋势,72 h最高,分别为6.29、5.37 ng/(g·FW),C-PTIO处理呈先上升后下降趋势,46 h最高,为4.79 ng/(g·FW)。在27～54 h,3个处理间tzR含量差异不显著;72 h时CK处理和SNP处理 tzR含量比C-PTIO处理分别提高73.12%和68.50%,CK处理和SNP处理间tzR含量无显著差异。表明,与CK处理相比,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中SNP处理对内源tzR含量没有明显影响,而C-PTIO处理在前期对内源tzR含量没有明显影响,而在后期会显著抑制内源tzR含量。

图10 不同处理tzR含量变化Fig.10 Changes of tzR content under different treatments

由图11可知,CK处理和SNP处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源czR的含量随时间延长均呈上升趋势,72 h最高,分别为31.79、38.20 ng/(g·FW),C-PTIO处理呈先上升后下降趋势,在54 h最高,为25.25 ng/(g·FW)。在27～46 h,3个处理间czR含量差异不显著;54 h时SNP处理 czR含量比CK处理和C-PTIO处理分别提高20.48%和30.35%,CK处理和C-PTIO处理间czR含量无显著差异;在72 h,SNP处理 czR含量比CK处理和C-PTIO处理分别提高16.77%和68.10%,CK处理 czR含量比C-PTIO处理提高61.67%。表明,与CK处理相比,马铃薯创伤愈合过程中,SNP处理在一定程度上可以促进内源czR的积累,C-PTIO在一定程度上会抑制内源czR的积累。

图11 不同处理czR含量变化Fig.11 Changes of czR content under different treatments

由图12可知,CK处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源iP的含量随着时间的延长呈上升趋势,72 h最高,为1.88 ng/(g·FW),SNP处理和C-PTIO处理呈先上升后下降趋势,在54 h最高,分别为1.73、2.02 ng/(g·FW)。在27 h,SNP处理 iP含量比CK处理提高31.96%,SNP处理和C-PTIO处理间、CK处理和C-PTIO处理间iP含量无显著差异,46～72 h,3个处理间iP含量差异不显著。表明,与CK处理相比,在马铃薯块茎愈伤木栓化前期,SNP处理和C-PTIO均对iP含量的积累有一定促进作用,而在马铃薯块茎愈伤木栓化后期,SNP处理和C-PTIO对iP的积累均表现出抑制作用。

图12 不同处理iP含量变化Fig.12 Changes of iP content under different treatments

由图13可知,3个处理中,马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源iPA的含量随着时间延长呈先上升后下降趋势,在27 h最高,分别为33.86、45.28、31.70 ng/(g·FW)。在27和54 h,SNP处理 iPA含量比CK处理分别提高25.22%、40.95%,比C-PTIO处理分别提高29.98%、39.14%,CK处理和C-PTIO处理间iPA含量无显著差异;在46 h,SNP处理 czR含量比CK处理和C-PTIO处理分别提高48.54%和33.59%,C-PTIO处理 czR含量比CK处理提高22.50%;在72 h,SNP处理 czR含量比CK处理和C-PTIO处理分别提高33.40%和79.40%,CK处理 czR含量比C-PTIO处理提高69.06%。表明,与CK处理相比,SNP处理对马铃薯块茎愈伤木栓化过程中内源iPA含量的积累有促进作用;在前期和后期,C-PTIO处理对内源iPA的积累有抑制作用,而在中期,C-PTIO对iPA的含量积累也有促进作用。

图13 不同处理iPA含量变化Fig.13 Changes of iPA content under different treatments

3 讨 论

3.1 植物激素ABA、ACC、SA和IAA对植物创伤木栓化影响

在植物应激反应中,ABA、ACC、SA和IAA等植物激素发挥着重要作用。迅速减少伤口表面的水分损失对于防止伤口部位细胞的干燥和死亡至关重要,而植物创伤木栓化过程必须依赖活细胞[13]。植物创伤后容易导致病菌侵入,高鹏华等[14]使用外源激素处理灰霉病胁迫下月季中各种酶活性变化发现,ABA可以降低SOD活性,提高POD活性,增强月季对灰霉病的抗性。NO参与ABA调控的气孔关闭[15],张梅花等[16]使用NO和ABA处理马铃薯块茎创面发现创伤马铃薯块茎创面软木脂显著积累,块茎创面愈合加快。Song等[17]研究证明乙烯通路下的转录因子ENI3与MYC2转录因子的互作拮抗方式调控植物对咀嚼式昆虫的抗性。Liu等[18]研究发现SA在提高沙棘果实对沙棘果蝇机械损伤的抗性中也起着重要作用。高彬[19]研究发现,NO处理可使SA含量迅速增加,与本研究的结果相符合。Fbbri等[20]研究发现,马铃薯块茎组织损伤时,游离态的IAA会快速增加。本研究结果表明,0～72 h,CK处理中,马铃薯块茎创伤使ABA和ACC的含量先下降,并在后期保持相对稳定的状态;而SA和IAA含量先快速上升,后期保持较高的状态;外源NO处理后,对ABA、ACC、SA、IAA含量都有不同程度的促进作用,而C-PTIO会降低块茎中这些激素的含量。说明外源NO处理可以促进ABA、ACC、SA和IAA含量增加,使其应对机械损伤。

3.2 JA对植物创伤木栓化影响

JA可以参与植物非生物胁迫,使植物产生反应。细胞壁破坏导致茉莉酸酯(JAs)积累,茉莉酸酯是激活植物诱导防御反应的关键信号分子。Taurinod等[21]研究发现,在马铃薯植株发育过程中,JAs介导了植物防御屏障中果胶基质的修饰。Zhou等[22]用MeJA处理创伤处理的马铃薯块茎发现,苯丙烷代谢的关键酶PAL等活性增强,同时促进创伤木栓化重要代谢产物聚酚软木脂的大量积累。马铃薯块茎创伤后能显著增加JA含量[23]。本研究表明马铃薯块茎栓化愈合过程中,JA、JA-Ile、cis-OPDA含量会在短时间内显著上升,而后又迅速降低,外源NO会对茉莉素积累起抑制作用,而C-PTIO对其含量积累反而有促进作用,说明NO可能是JA的负调控因子,外源NO加入反而使内源JA含量降低,而NO清除剂C-PTIO处理降低了NO含量,低浓度NO会诱导JA产生。

3.3 CTK对植物创伤木栓化影响

Lulai等[24]研究发现,创伤马铃薯块茎在愈合的第二阶段(WPF)细胞分裂过程中,分生组织活动对低水平细胞分裂素具有较强的敏感性。孙源长等[25]研究表明,玉米素生物合成途径在芦竹茎对盐胁迫响应中发挥重要作用。本研究表明马铃薯创伤块茎在自然状态和外源NO处理的情况下,cZ、tzR、czR、iP含量在0～27 h不断升高,iPA、tZ含量在创伤前期快速升高,然后不断降低,可以推断tZ和iPA在接近闭合层形成的后期,在创伤周皮形成前,对随后的木栓形成层起调节作用;外源NO对细胞分裂素中tZ、czR、iPA含量有促进作用,对cZ、tzR、iP的促进作用不明显,但C-PTIO处理对cZ、tzR、czR、iP和iPA含量在后期有抑制作用。

4 结 论

在马铃薯块茎创伤愈合过程中,外源NO处理块茎可以提高块茎中ABA、ACC、SA、IAA等内源激素的含量,提高植物对机械损伤抗性,但JA变化不明显,而C-PTIO和CK处理则表现为先上升后下降,说明NO可能是JA的负调控因子。外源NO对细胞分裂素中tZ、czR、iPA含量有促进作用,对cZ、tzR、iP促进作用不明显,但在后期C-PTIO处理对cZ、tzR、czR、iP和iPA含量有抑制作用。