复方苦参注射液生物碱类成分及血中移行成分的分析

张 莉,吴 欢,尹艳艳

(1.安徽医科大学基础医学院药理学教研室,安徽 合肥 230032;2.安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 230038)

复方苦参注射液(Compound Kushen Injection,CKI)又称“岩舒注射液”,是由苦参及白土苓饮片提取精制而成的灭菌水溶性制剂［1］,具有清热解毒、凉血利湿、散结止痛之功效。CKI临床主要用于抑制肿瘤并缓解癌性疼痛,疗效确切［2-3］。近年来有研究［4-5］表明,生物碱是CKI的主要活性成分,其抑制肿瘤的作用及机制也逐渐被揭示。中药制剂的体内外物质基础研究是中药现代化、国际化的核心问题,能从本质上揭示中药作用的科学内涵,同时也为其质量控制提供依据。马悦［6］利用液质联用结合核磁共振技术识别了CKI中11种化学成分,然后利用高效液相色谱建立了27批CKI的指纹图谱并指认了8个色谱共有峰,研究取得一定进展。但CKI中生物碱类成分仍需系统研究,尤其是其血中移行成分。

超高效液相色谱—电喷雾离子化—四极杆飞行时间质谱(ultra-high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-ESI-QTOF/MS)具有分离性能好、灵敏度高、分辨率高、动态扫描范围宽等优点,已被广泛应用于中药体内外物质基础的研究［7-9］。本研究采用UHPLC-ESI-QTOF/MS的全信息串联质谱技术(full information tandem mass spectrometry,MSE)采集样品信息,然后基于UNIFI构建靶向筛查策略识别CKI中生物碱类成分及血中移行成分,以期为CKI的质量控制及药效物质研究提供参考。

1 仪器与材料

UHPLC-ESI-QTOF/MS配有ACQUITY I-Class UHPLC系统(包括在线脱气器、恒温控制柱室、自动取样器和四联泵)和Xevo G2-XS QTOF系统:美国Waters公司;Masslynx 4.1工作站和UNIFI软件:美国Waters公司;Milli-Q超纯水净化系统:美国Millipore公司;CKI(总生物碱含量为20.8 mg/mL):山西振东制药股份有限公司;色谱级乙腈:德国Merck公司;甲酸:上海Aladdin有限公司。

2 方法

2.1 CKI样品溶液及空白溶液的制备 取CKI 10 mL,减压离心挥干溶剂。加入2 mL甲醇,涡旋振荡30 s使残渣溶解,12 000 r/min离心10 min。取上清1 mL至100 mL量瓶中,甲醇稀释并定容至刻度,摇匀,0.22 μm微孔滤膜滤过,即得CKI样品溶液。取生理盐水10 mL同法制备即得空白样品。

2.2 动物实验 12只SPF级健康雄性SD大鼠,体质量约200 g,由安徽医科大学实验动物中心提供,动物生产许可证号为SCXK(皖)2017-001。适应性饲养7 d(温度和湿度分别为25 ℃±2 ℃和50%±10%,昼夜交替时间为12 h)。大鼠禁食12 h后,随机分为CKI组和空白组,每组6只。CKI组大鼠腹腔注射CKI 2 mL,隔日1次,连续2次。空白组给予等量生理盐水。末次给药后,分别于0.5、1、2、4、8、12、24 h从眼下静脉采集0.5 mL血液,置于肝素化EP管中。4 ℃ 、3 000 r/min离心5 min后,取上清,即得血浆样品。将不同时间点所取血浆合并后,置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.3 CKI血浆样品及空白血浆的制备 取1 mL血浆,平均分成5份,每份200 μL。将200 μL血浆置于1.5 mL EP管中,加600 μL预冷甲醇,旋涡振荡10 s,4 ℃、13 000 r/min离心10 min。取上清,用氮气吹干。加200 μL预冷甲醇重新溶解残渣,合并5份残渣混合液,旋涡混合30 s,4 ℃、13 000 r/min离心10 min,取上清,再次用氮气吹干,加入100 μL预冷甲醇,旋涡混合30 s,4 ℃、13 000 r/min离心10 min,即得CKI血浆样品溶液。空白组血浆亦按此方法处理。

2.4 UHPLC条件 采用ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1 mm×10 cm,粒径为1.7 μm)对复杂组分进行色谱分离,柱温为35 ℃;进样量及流速分别为2 μL和0.2 mL/min。流动相由0.01 mol/L醋酸铵溶液(A)和乙腈(B)组成。洗脱程序:6% B,0～2.0 min;6%～15% B,2.0～4.0 min;15%～25% B,7.5～14.0 min;25%～45% B,14.0～16.0 min;45%～90% B,16.0～18.0 min;90%～100% B,20.0～21.0 min;100%～6% B,23.0～24.0 min;6% B,24.0～27.0 min。

2.5 QTOF/MS条件 采用ESI-QTOF/MS进行质谱检测。运行参数:毛细管电压3.0 kV,锥孔电压40.0 V。离子源和干燥气的温度分别为120 ℃和400 ℃。锥孔气体流速为40 L/h,干燥气体流速为600 L/h。数据采集速率0.5 spectrum/s,扫描范围50～1 200 Da。使用亮氨酸—脑啡肽(200 pg/mL)在10 μL/min流速下进行实时数据校正。MSE模式下的低、高碰撞能量分别为4 V和20～35 V。

2.6 数据分析方法 首先,建立CKI生物碱化学成分数据库。以苦参作为关键词检索PubMed、Web of Science、Medline和CNKI等数据库,收集CKI可能含有的生物碱类成分信息(包含化合物名称、分子式及结构式)并输入至Excel表格中。然后,将UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE［其中低碰撞能(4 V)获取母离子精确质量,高碰撞能(20～35 V)获取碎片离子精确质量］采集的CKI样品及空白样品源文件和CKI生物碱化学成分数据库一起导入UNIFI软件进行靶向筛查。UNIFI软件参数设定:二维［2D,包含保留时间(retention time,tR)和离子强度］检测最小峰面积为200;三维(3D,包含tR、离子强度和m/z)检测的低、高碰撞能量下峰强度分别设置为500和150;tR偏差为±0.1 min;质量误差为±5×10-6。待识别出CKI所含的生物碱类成分后,以这些成分重新建库,连同UHPLC-ESI-QTOF/MSE采集的CKI给药后大鼠血浆及空白血浆导入UNIFI软件进行血中移行成分的筛查。依据母离子、碎片离子的精确质量对筛查出的化合物结构进行确认。最后验证结果,对UNIFI输出的结果进行逐一核实,当在空白组和CKI组样品谱图的同一tR处提取到离子强度相近的离子流时,则认为该成分为假阳性结果,应予以剔除。

3 结果

3.1 UHPLC-ESI-QTOF/MS条件的优化 流动相的表面张力、黏度及流速越低,越有利于ESI源电喷雾离子化。因此,有机相选择表面张力和黏度均较低的乙腈,流速设为0.2 mL/min。生物碱容易荷正电荷,离子检测模式设置为ESI+模式。水相分别考察了纯水、0.5%乙酸溶液、0.1%甲酸溶液和0.01 mol/L醋酸铵溶液,其中0.01 mol/L醋酸铵溶液作为水相与乙腈进行梯度洗脱时,化合物峰形和分离度均较好。因此,选择乙腈-0.01 mol/L醋酸铵溶液作为洗脱液。

3.2 CKI样品中生物碱成分分析 采用UHPLC-ESI-QTOF/MSE检测CKI样品溶液及空白溶液。在正离子模式下CKI样品溶液和空白溶液的总离子流图见图1。根据“2.6”项下构建的靶向筛查策略对CKI中生物碱类成分进行定性分析。共识别出20种生物碱类成分,包括12种苦参碱型、3种金雀花碱型、3种羽扇豆碱型、2种苦豆碱型成分,具体结果见表1。

表1 CKI生物碱类成分的UHPLC-ESI-QTOF/MSE色谱及质谱数据

图1 空白样品(A)和CKI样品(B)在ESI+模式下的总离子流色谱图

以峰7为例解析苦参碱类化合物的识别过程。低碰撞能量下峰7(tR=3.65 min)检测到加合离子［M+H］+的m/z为 265.191 2,以MassLynx 4.1的元素组成工具推测其分子式为C15H25N2O2;高碰撞能量下观察到247.181 9、205.133 9、150.128 1、148.111 7、136.111 4、120.080 4等碎片离子;其中,m/z247.181 9为m/z265.191 2脱去一分子H2O而产生,接着m/z247.181 9发生电荷转移并经过系列i裂解后生成205.133 9、150.128 1和148.111 7,其中148.111 7可进一步脱去C2H4生成120.080 4的碎片离子。见图2。因此,经UNIFI靶向筛查并结合其母离子、碎片离子精确质量以及裂解特征,推测该化合物为氧化苦参碱。

图2 氧化苦参碱的质谱图(A)和裂解途径(B)

3.3 CKI血中移行成分分析 利用UHPLC-ESI-QTOF/MSE检测“2.3”项下获得的CKI血浆样品及空白血浆样品。将“3.2”项下的20种CKI生物碱成分重新建库并导入UNIFI,自动比对含药血浆及空白血浆,靶向筛查出血中移行的生物碱类成分。共有17种成分能够在血浆中被检出,包括10种苦参碱型(5α,9α-二羟基苦参碱、9α-羟基苦参碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、14β-氧化槐定碱、槐醇碱、氧化槐定碱、槐定碱、苦参碱和槐果碱)、2种金雀花碱型(N-甲基金雀花碱、菱叶碱)、3种羽扇豆碱型(氧化黄叶槐碱、黄叶槐碱、lamprolobine)、2种苦豆碱型(鹰靛叶碱、羽扇烷宁)成分。

4 讨论

多项临床研究表明,CKI对恶性肿瘤如肝癌［10］、胃癌［11］、肺癌［12］、乳腺癌［13］具有较好的疗效,肿瘤抑制作用可能与其抑制癌细胞增殖,诱导细胞周期阻滞,加速凋亡,抑制血管生成,抑制肿瘤转移和侵袭有关［5,13］。已有研究［4］表明,苦参碱和氧化苦参碱等生物碱类成分是CKI的主要活性成分,它们对人肝癌细胞(SMMC-7721)、胃癌细胞(MKN45和SGC-7901)以及乳腺癌细胞系(MCF-7)有不同程度的抑制作用。然而,中药制剂具有多成分、多靶点协同作用的特点,其血中移行成分是其发挥治疗作用的潜在活性物质［9］。因此,有必要对CKI生物碱类组分及血中移行成分进行系统分析。

UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE模式是一种能够实现高、低碰撞能量切换扫描的数据非依赖性采集技术,能在一次样品采集过程中同时捕获母离子和碎片离子的精确质量,并依据它们的色谱行为进行关联和匹配［14-15］,降低了数据采集次数。由于中药制剂化学成分具有多样性和复杂性,传统的手动提取离子流,依据母离子及碎片离子等信息进行人工解谱的过程复杂且耗时;在有基质干扰的情况下,响应信号小或含量低的成分在MSE采集模式下易发生漏判［15］。作为一种简单高效的数据分析平台,UNIFI能对UHPLC-ESI-QTOF/MS的MSE数据进行采集、峰提取、分子式确定,也能比对含药样品及空白样品的差异并与库中化合物进行匹配,依据碎片离子对化合物进行推导,最后输出拟识别化合物的信息［16］。

本研究通过UHPLC-ESI-QTOF/MSE技术结合靶向筛查策略识别了CKI中20生物碱类成分及17种血中移行成分,为其药效物质的系统阐明及质量控制体系的建立奠定了基础。