牙鲆细胞因子M17蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

苏玉凤　马倩倩　孙敬锋

摘    要：M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用。为了制备牙鲆（Paralichthys olivaceus）M17蛋白的多克隆抗体，将M17基因插入pET-32a原核表达载体，构建M17基因原核表达质粒pET-32a-M17。将构建的质粒pET-32a-M17转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞，通过IPTG诱导M17蛋白表达，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化M17重组蛋白。利用纯化的重组M17蛋白免疫小鼠获得M17多克隆抗体（抗血清）。结果显示，IPTG诱导后M17蛋白分子质量大小约为50.0 ku，M17重组蛋白主要以包涵体表达为主；Ni-NTA亲和层析柱纯化后透析复性后M17重组蛋白浓度为597 μg·mL-1；多克隆抗体经双向琼脂免疫扩散法检测抗体效价为1∶16，经Western blotting分析可见单一目的条带，说明制备的多克隆抗体具有较强的特异性。综上可知，M17重组蛋白表达成功，且制备的抗M17多克隆抗体可用于M17蛋白的生物学功能研究。

关键词：牙鲆；M17蛋白；原核表达；重组蛋白；多克隆抗体

中图分类号：S96         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.08.008

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of M17 Protein in Flounder （Paralichthys olivaceus）

SU Yufeng， MA Qianqian， SUN Jingfeng

（College of Fisheries， Tianjin Agricultural University/Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture， Tianjin 300384， China）

Abstract： M17， a member of cytokine IL-6 subfamily， has cytokine-like functions and exerts antiviral and antibacterial effects in fish. To prepare polyclonal antibody against the M17 protein of Paralichthys olivaceus， the M17 gene was inserted into the pET-32a vector to construct a prokaryotic expression plasmid pET-32a-M17. The constructed plasmid pET-32a-M17 was transformed into competent E. coli BL21（DE3） cells， and the expression of M17 protein was induced by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The polyclonal antibody （antiserum） was obtained by immunizing mice with purified recombinant M17 protein.The results showed that the molecular weight of M17 protein was 50.0 ku， and the recombinant M17 protein was mainly expressed in inclusion body. After purification by Ni-NTA affinity chromatography， the concentration of M17 recombinant protein was 597 μg·mL-1. The titer of the polyclonal antibody was 1∶16 by double immunodiffusion. A single target band was observed by western blotting analysis， indicating that the prepared polyclonal antibody had a strong specificity. These results indicates that the recombinant M17 protein is successfully expressed， and the prepared anti-M17 polyclonal antibody could be used to study the biological function of M17.

Key words： Paralichthys olivaceus; M17 protein; prokaryotic expression; recombinant protein; polyclonal antibody

哺乳動物白细胞介素（IL）-6细胞因子家族包括IL-6、抑癌素M（OSM）、IL-11、纤毛神经营养因子（CNTF）、心肌营养素样细胞因子（CLC）、白血病抑制因子（LIF）、心肌营养素-1（CT-1）和IL-27[1-5]。IL-6细胞因子家族是造血、神经内分泌和免疫系统的主要参与者，既具有促进炎症的功能，也可以抵抗炎症发作[2，6-7]。一些研究已证实，在鱼类中存在IL-6、IL-11、CNTF和M17等IL-6细胞因子家族，而M17被鉴定为可能是LIF和OSM的祖先分子的鱼类特异性分子[7]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）属鲽形目（Pleurone-ctiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆属（Paralichthys），是我国名贵的海产鱼类，但在养殖过程中会面临如杀鱼爱德华氏菌或鰻弧菌等各种病害威胁[8]。M17是鱼类细胞因子IL-6亚族家族的成员之一，M17具有细胞因子样功能，在鱼体内发挥抗病毒和抗细菌的作用[9]。此外，Hanington等[7]研究发现，M17可诱导金鱼巨噬细胞分化和一氧化氮的产生。M17在巨噬细胞亚群中的表达量比在单核细胞和祖细胞中高，而且在激活的巨噬细胞内表达被上调，用重组的M17处理单核细胞亚群会加速单核细胞向巨噬细胞分化，说明它在髓细胞生成中发挥重要作用。Wang等[10]研究发现，抑制M17在神经系统中会延迟恢复视神经损伤。目前，有关M17的分子生物学特征以及免疫生物学活性，特别是对鱼类机体非特异性免疫和特异性免疫调节作用的研究尚未见报道。为此，本研究构建M17的原核表达载体pET-32a-M17，利用原核表达M17制备M17多克隆抗体，为研究牙鲆M17的功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 基因、载体及试剂

牙鲆M17基因M17的全长cDNA由天津市水产生态及养殖重点实验室克隆于pMD18-T载体上。原核表达载体pET-32a、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Rosetta（DE3）由天津市水产生态及养殖重点实验室保存。限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ ，宝生物工程（大连）有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），北京索莱宝科技有限公司；Ni-NTA亲和层析柱、蛋白Marker，Merck公司；羊抗鼠IgG-HRP、Anti-His Antibody、Western-blotting硝酸纤维素膜，北京天根生化科技有限公司；健康BALB/c小鼠10只，雌性，4～5周龄，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。

1.2 M17原核表达载体构建

PCR扩增M17的ORF区的引物采用生物软件BioEdit设计，由华大基因合成，预期扩增片段为600 bp。上游引物M17-F：5'-CGCGGATCCAATGGTTATG

TAAAGAGAATGA-3'，并引入一个上游BamH I限制性位点（下划线）；下游引物M17-R：5'-CCCAAGCTTGTATCCCCCTGCAGACTTTG-3'，引入一个Hind III限制性位点（下划线）。以pMD18-T-M17为模板，M17-F和M17-R为引物进行PCR扩增。95 ℃预变性12 min；94 ℃变性30 s，56.3 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，连续30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经BamH I和Hind III双酶切、凝胶纯化后连接到同酶双酶切的pET-32a表达载体上。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。阳性克隆经菌落PCR和DNA测序证实。理论上，得到的重组质粒pET-32a-M17可以表达C端带有额外6-His标签的M17融合蛋白，这有利于通过Ni2+螯合亲和纯化融合蛋白。

1.3 M17重组蛋白表达与可溶性检测

阳性克隆菌株经测序鉴定正确后，将表达菌株pET-32a-M17置于LB/Amp液体培养基中振荡培养过夜。次日，按照体积比1∶100加入到200 mL同样的培养液中，37 ℃振荡培养。当菌液OD600 nm达到0.5～0.6时，分别加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，37℃诱导4 h，取出50 mL菌液12 000 r·min-1离心10 min收集菌体沉淀。将菌体重悬于15 mL的PBS缓冲液中，超声破碎菌体（超声程序为：300 W，工作5 s，间歇10 s，共8 min），12 000 r·min-1离心10 min分别收集上清液和沉淀，并以未用IPTG诱导，未超生破碎菌液和pET-32a空载体转化大肠杆菌Rosetta（DE3）做对照，进行12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析。

1.4 M17重组蛋白纯化

按照Merck公司Ni-NTA亲和层析柱说明书纯化表达蛋白。步骤如下，对单克隆阳性菌进行扩大培养，诱导重组蛋白表达，参照1.3离心收集100 mL菌液的菌体并加入4 mL预冷的1×结合缓冲液，重悬菌体，超声波破碎，4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀。加入与5 mL预冷含6 mol·L-1盐酸胍的1×结合缓冲液，重悬沉淀，冰浴1 h，4 ℃下12 000 r·min-1离心30 min，去除不溶成分。用0.45 μm滤膜过滤，取上清液。将上清加到1 mL50% Ni-NTA His·Bind树脂悬浮液中，4 ℃轻柔混匀（300 r·min-1），室温结合60 min。加样至空色谱柱中，除去柱下端封闭盖子，以4 mL Bufffer B漂洗杂蛋白2次，以0.5 mL Bufffer C洗脱目的蛋白4次。对纯化的蛋白进行透析和浓缩，采用考马斯亮蓝法测定样品中蛋白的浓度并通过SDS-PAGE电泳和Western blotting进行验证，-80 ℃保存备用。

1.5 多克隆抗体制备及检测

将纯化复性M17蛋白用于免疫10只小鼠制备抗体。免疫前，每只小鼠尾静脉取血1 mL，血液在37 ℃放置1 h后，置于4 ℃过夜，然后在4 ℃下以5 000 r·min-1离心20 min。收集血清作为阴性对照。具体免疫方案如表1所示。首次免疫将M17蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合乳化后，背部和腹腔多点皮下注射免疫小鼠。2周后，使用弗氏不完全佐剂乳化重组蛋白，采用腹腔皮下注射，加强免疫2次，每次间隔7 d。之后采用腹腔皮下注射M17蛋白4次，每次间隔7 d。第7次免疫5 d后，通过眼球采小鼠血，根据上述方法收集抗血清并随后在-80 ℃保存直至进一步使用。采用双向琼脂凝胶免疫扩散法检测抗体效价，并采用Western blotting检测抗血清特异性。

1.6 双向琼脂扩散实验测定抗血清效价

采用双向琼脂凝胶免疫扩散法检测抗体效价，具体步骤参照张淑莉等[11]方法。将培养皿洗净烘干高压灭菌备用，配制1%生理盐水琼脂，倒平板，厚约2～3 mm，待琼脂凝固后，用打孔器打孔（孔径3 mm，孔间距5 mm），呈梅花形，挑去孔内琼脂。用移液器加样，中心孔加抗原原液约20 μL，周围各孔按顺序依次加入20 μL倍比稀释抗血清，抗体分别是1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，注意加样时以注满为度，不要有气泡。加完样后将培养皿置于湿盒内，放入恒温箱37℃扩散24 h，观察有无沉淀线产生，以出现明显沉淀线的最高稀释度作为检测血清效价。

1.7 Western blotting检测分析

用12%的SDS-PAGE将蛋白质分离后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中，在300 mA下，使用湿转法将蛋白转移到膜上60 min。在室温下，将膜在5%脱脂奶粉中孵育1 h，然后用PBST洗涤3次（每次10 min）。将膜与Anti-His Antibody（1∶300）或制备的抗M17多克隆抗体（1∶300）在4 ℃孵育过夜。洗涤3次后，将膜与二抗（HRP标记羊抗鼠IgG，稀释度为1∶500）在37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗涤3次，用PBS洗涤1次。使用DAB显色液避光显色，观察拍照。

2 结果与分析

2.1 pET-32a-M17重组质粒的构建与鉴定结果

采用PCR方法从pET-32a模板中扩增出编码M17蛋白的开放读码框。在引物中设计BamH I和Hind III位点，便于克隆到pET-32a载体中。将600 bp的PCR产物克隆到pET-32a载体中，转化感受态大肠杆菌DH5α。通过PCR和酶切筛选克隆（图1），菌落PCR鉴定结果显示，在600 bp处附近出现单一、明亮的目的条带，而阴性对照则无目的条带（图1-A）。双酶切验证结果可见在600 bp和6 300 bp处有电泳条带（图1-B）。

2.2 重组蛋白诱导表达及可溶性检测结果

pET-32a-M17重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，经1 mmol·L-1的IPTG诱导后取样，SDS-PAGE结果显示约50 ku左右出现表达条带，其大小与M17预测分子量一致。此外，诱导组的上清液中没有明显的条带出现（图2样品g），而沉淀中出现明显条带（图2样品h）。这说明目的蛋白主要在包涵体中表达。而阴性对照组pET-32a空载体转化大肠杆菌Rosetta（DE3）经IPTG诱导和不诱导，以及pET-32a-M17重组载体转化大肠杆菌Rosetta（DE3）不诱导均未见目的条带（图2样品a、b、c、d、e），与预期结果一致。

2.3 重组蛋白纯化及Western blotting检测结果

利用Ni-NTA亲和层析柱对M17重组蛋白的富集作用，通过洗脱液洗脱后进行SDS-PAGE电泳检测可看见在50 ku左右有目的蛋白条带，条带单一清晰（图3-A），纯化透析得到的M17重组蛋白浓度为579 μg·mL-1（表2），其Western blotting显示Anti-His Antibody能特异性识别大小约为50 ku的条带，其大小与SDS-PAGE结果一致，表明Anti-His Antibody所识别蛋白即为目的蛋白，且具有良好的生物活性（图3-B）。

2.4 免疫效价及特异性检测结果

纯化复性后的M17重组蛋白免疫小鼠制备M17多克隆抗体，采用琼脂糖双向扩散法检测其抗体效价结果表明该多克隆抗体的抗体效价达1∶16（图4-A），可进行抗原特异性识别。进一步采用Western blotting检测多克隆抗体的特异性，结果显示，各孔上等量的纯化的M17蛋白进行SDS-PAGE，利用不同稀释倍数的血清作为一抗在相同的孵育时间进行Western blotting，均在50 ku处可见单一条带，且1∶400倍稀释血清的条带最深，为最佳稀释浓度（图4-B）。

3 讨论与结论

免疫系统主要功能是防御和维护机体自身稳定，细胞因子是鱼类免疫系统的重要组成部分。细胞因子M17是神经系统和免疫系统的参与者，在鱼体内可发挥抗病毒和抗细菌的作用[9]。在国外研究中，M17已在鲤鱼、金鱼、斑马鱼、绿斑点河豚和虎河豚中被报道[7，9-10]。然而，M17的研究目前仅涉及克隆基因以及分析细菌、脂多糖和肽聚糖对M17在鱼体内表达的影响。有关M17的分子生物学特征以及免疫生物学活性的研究尚未见报道。为此，本研究利用原核表达M17制备M17多克隆抗体，为研究牙鲆M17的功能打下基础。

基因重组技术在分子生物学实验室是一项非常重要的技术，可使目的DNA在外源宿主细胞中繁殖并表达以产生重组蛋白[12]。根据表达宿主的不同，蛋白质表达系统可分为原核和真核表达系统。其中，真核表达系统具有翻译后加工修饰的功能，但成本高。原核表达系统是研究最多、掌握最成熟的表达系统，不仅成本低，表达效率还高，适用于制备多克隆抗体[13-14]。pET系列载体具有构建效率高、蛋白表达量高、标签小、易分离纯化等优势[15]。pET-32a表达载体在N-端和C-端均有His-Tag标签，后续可采用Ni-NTA亲和层析柱对蛋白进行纯化。因此，本研究采用pET-32a表达载体构建pET-32a-M17重组质粒，并转化BL21（DE3）感受态細胞，在IPTG诱导下M17重组蛋白主要在包涵体中得到高效的表达。而包涵体形成的主要原因是原核表达系统缺乏翻译后修饰过程和辅助蛋白折叠的机制，使得外源基因没有办法达到自发折叠和卷曲，从而不能形成具有一定结构和功能的蛋白质，只能以不溶性沉淀物的形式表达[16]。包涵体的聚集不会使酶或蛋白失活[17]。因此，本研究采用包涵体的纯化方法直接纯化M17重组蛋白用于制备M17的多克隆抗体，发现抗体能与纯化的M17蛋白发生特异反应，为今后开展 M17蛋白的表达定位、Western blotting、免疫沉淀等试验奠定基础。本研究成功诱导表达M17蛋白并制备了M17多克隆抗体，为进一步开展M17蛋白功能与作用机制的研究提供了重要保障。

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收稿日期：2023-04-18

基金項目：天津市海水养殖产业技术体系创新团队（ITTMRS2021007）

作者简介：苏玉凤（1996―），女，广东高州人，在读硕士生，主要从事鱼类疾病与免疫学研究。

通讯作者简介：孙敬锋（1976—），男，山东泰安人，教授，博士，主要从事水产动物疾病与免疫防控研究。