创伤性脑损伤合并肢体骨折后骨折愈合加速机制的研究进展

陆安静,王庭刚,王瑞烈,杨 光,郭国宁,潘均伟,陆元兰

遵义医科大学附属医院急诊科,贵州 遵义 563003

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)合并骨折是严重多发伤的常见类型之一,是目前重要的公共卫生问题,而TBI合并骨折患者出现骨折愈合加速的现象已在临床中被广泛认识。最早于20世纪60年代,由Gibson和Robert发现相较于单纯肢体骨折患者,TBI合并肢体骨折患者的骨折端有大量骨痂形成,肌肉内也有异位骨化现象,证实TBI可缩短骨折愈合时间。通过骨折断端生物力学和影像学检查也说明了骨折合并TBI较单纯骨折的骨痂密度增加,骨间隙桥接率增高,骨折愈合加速进展到重塑阶段。因此阐明TBI和骨折之间的关系具有重要意义,但其具体机制仍然不明。本文就TBI导致骨折愈合加速的研究进展进行回顾分析,旨在为更加深入了解该现象背后的机制,为临床治疗骨折提供参考。

1 TBI后非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)对骨折愈合的影响

1.1微小RNA(microRNA,miRNA) miRNA是一种无编码蛋白质功能,长18～22个核苷酸的单链小分子ncRNA,它可以与信使RNA(message ribonucleic acid,mRNA)上的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)结合,降解mRNA或直接抑制其翻译,影响细胞发育、增殖、分化和凋亡[1]。研究发现TBI合并股骨骨折患者血清及骨痂中的miRNA-26a-5p含量较单纯股骨骨折患者明显增加[2]。高表达的miRNA-26a-5p直接靶向作用于磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因mRNA的3’UTR,下调PTEN mRNA表达,通过激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/丝苏氨酸蛋白激酶(serine protein kinase,AKT)信号通路,促进成骨细胞分化,加速骨折愈合[2]。另外有研究发现TBI合并股骨骨折小鼠中,miRNA-92a-3p与整合素结合唾液酸蛋白mRNA的3’UTR结合,同样激活PI3K/AKT信号通路,导致成骨细胞特异性靶基因的转录表达增加[3]。B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)在多种细胞系统作为抗凋亡分子,其过表达与成骨细胞凋亡减少和成骨基因表达增加相关。细胞周期蛋白(cyclin)通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶的活性,调控成骨细胞周期的进行,促进成骨细胞增殖。而Bcl-2和细胞周期蛋白的表达下调抑制了成骨细胞分化。有研究发现TBI合并股骨骨折患者血清内miRNA-16-5p的含量明显低于单纯股骨骨折患者,体外实验证实miRNA-16-5p的过表达显著抑制小鼠胚胎成骨细胞前体细胞的增殖,负向调控骨折的愈合[4]。进一步研究发现miRNA-16-5p通过负向调控Bcl-2 mRNA、cyclin D1 mRNA的表达,促进成骨细胞凋亡和抑制成骨细胞增殖[4]。在TBI合并胫骨骨折患者血清中miRNA-433的表达低于单纯胫骨骨折患者,分泌性磷蛋白1(secretory phosphoprotein 1,SPP1)mRNA和蛋白表达增加,SPP1可由成骨细胞分泌,并能促进成骨细胞的分化和增值[5]。证明是miRNA-433与SPP1mRNA的3’UTR结合,上调SPP1 mRNA和蛋白表达,进而影响骨折处骨痂的形成[5]。综上,TBI合并骨折后,通过上调或下调miRNA的表达,并与下游相应靶点的3’UTR结合后调控成骨相关分子的表达,促进骨折愈合。

1.2长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA) lncRNA是一种长度超过200个核苷酸,且不能翻译蛋白质的ncRNA。lncRNA在细胞中的定位决定它发挥怎样的功能,在胞质中可通过与mRNA的结合来调控蛋白质的翻译和降解;定位在细胞核中则与DNA的修饰、染色质修饰、DNA甲基化等有关。研究表明lncRNA在调节成骨细胞分化上有着关键的作用。Wnt/β-catenin信号通路能促进骨细胞增殖和分化、阻止细胞凋亡,还能促进成骨细胞的前体骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的分化和矿化[6]。Jiang等[7]研究发现lncRNA-抗分化非编码RNA(lncRNA-differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,lncRNA-DANCR)通过激活Wnt/β-catenin信号通路来促进成骨细胞的增殖和分化。miR-138和miR-145通过靶向E盒结合锌指蛋白2(zinc finger E-box-binding protein 2,ZEB2)抑制Wnt/β-catenin信号通路,负调控人BMSCs的成骨分化,而lncRNA-linc-ROR能直接结合于miR-138和miR-145,抑制它们的表达,进而促进BMSCs成骨分化[8]。Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx2)在破骨细胞和成骨细胞分化中起着至关重要的作用,还是BMSCs成骨分化的早期标志物。在家兔胫骨骨折中,通过下调lncRNA-ANCR并触发Runx2的表达,能促进胫骨骨折愈合[9]。Guo等[10]通过对单纯肢体骨折患者以及TBI合并肢体骨折患者的血清进行了lncRNA测序,共筛选出了4种高表达的lncRNA,通过构建lncRNA-细胞相互作用网络图,发现lncRNA可能通过调节嗜碱性粒细胞、细胞毒性T细胞、B细胞和内皮细胞的生物学行为,参与TBI加速骨折愈合,但这4种lncRNA在骨折愈合中的具体作用机制尚未阐明。综上,lncRNA具有促成骨作用,而TBI后骨折愈合加速可能是通过lncRNA实现的。

2 TBI后信号素3A(semaphorin 3A,SEMA3A)对骨折愈合的影响

SEMA3A属于信号素家族中的Ⅲ型分泌型蛋白,具有促进树突分支、轴突生长和引导神经元迁移的作用,有研究发现SEMA3A在免疫系统、心血管系统及骨骼系统中有调节作用[11]。研究发现,SEMA3A可能是TBI后骨折愈合加速的重要原因。Yang等[12]证实小鼠TBI后SEMA3A的表达上调,并在第3天时达到峰值。Hayashi等[13]研究证明SEMA3A通过与其功能性受体神经毡蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)结合后,阻断下游的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)和Ras同源基因家族蛋白A(Ras homolog gene family member A,Rho A)信号通路,抑制受体激活核因子-κ配体(receptor activator of nuclear factor κBligand,RANKL)诱导的破骨细胞分化,通过经典的Wnt/β-catenin信号通路刺激成骨细胞分化。因此SEMA3A可通过刺激成骨细胞分化并同时抑制破骨细胞分化来发挥成骨作用。由于SEMA3A及其受体也在交感神经及感觉神经元中表达,因此有研究认为SEMA3A是通过调节感觉神经在骨小梁的分布间接调节骨发育,而不是直接作用于成骨细胞[14]。此外,在胫骨骨折小鼠骨折处局部注射SEMA3A可以增加骨折处骨痂密度及体积,加速骨的重塑[15]。研究发现TBI合并胫骨骨折大鼠软骨痂中软骨细胞SEMA3A和NRP-1高表达,而在新生骨小梁周围成骨细胞中低表达,推测SEMA3A/NRP-1信号系统通过影响软骨细胞分化和增殖,而未能及时调控成骨细胞分化,是导致骨折合并TBI后软骨痂生成较多的原因之一[16]。综上,SEMA3A与TBI后成骨作用增强密切相关,表明SEMA3A是促进骨折愈合的潜在治疗靶点。

3 TBI后神经肽对骨折愈合的影响

降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一种由37个氨基酸组成的神经肽,中枢神经系统中以脊髓分布最多,大脑皮质次之。研究发现CGRP可以调节成骨细胞和破骨细胞的活性,对骨折的愈合起调节作用。用CGRP培养人成骨细胞,能上调人成骨细胞的β-catenin mRNA表达量,同时伴随成骨标志基因表达,包括:碱性磷酸酶(alkaline phospatase,ALP)、Ⅰ型胶原、骨钙素(osteocalcin,OC)、Runx2,进而影响成骨细胞的分化与成熟,这种上调作用能被CGRP受体拮抗剂所阻断[17-18]。Wang等[19]将CGRP加入到体外培养的BMSCs培养液中,应用Western Blot检测培养液中哺乳动物不育系20样激酶(mammalian sterile 20-like kinase 1/2,Mst1/2)的表达,Mst1/2是Hippo通路的核心分子;又用Hippo通路抑制剂维替泊芬阻断下游信号,结果显示CGRP能有效促进Ⅰ型胶原、ALP、Runx2等成骨相关蛋白的mRNA表达,Mst1/2的表达水平也增加;在加入维替泊芬后成骨相关蛋白mRNA表达下降,且Mst1/2表达也受到抑制,说明CGRP能够促进BMSCs的成骨分化,且Hippo信号通路介导了CGRP作用于小鼠BMSCs的成骨分化过程。进一步研究证实了Hippo/Yap信号通路可能参与了CGRP介导的BMSCs的迁移和成骨[19]。RANKL诱导的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的激活是破骨细胞活化和促进骨吸收的关键通路,CGRP可抑制该通路的表达,进而间接促进骨折愈合[20]。Xu等[21]研究发现TBI合并胫骨骨折家兔血清和脑脊液中的CGRP含量均较单纯胫骨骨折明显增加,推测TBI合并骨折并加速骨折愈合与血清中CGRP的快速增加有关。

骨折处血运重建是骨折愈合的另一个有利条件,这一过程取决于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的作用,它是公认的最有力血管生成因子。Li等[22]研究发现CGRP能激活VEGF/VEGFR信号通路的下游信号分子局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK),该物质参与血管内皮细胞的迁移和成熟,证实了CGRP-FAK-VEGF信号通路的成血管作用。Zhang等[23]发现TBI合并锁骨骨折组愈伤组织中的VEGF表达明显高于单纯锁骨骨折组,且骨折愈合时间较单纯锁骨骨折组短。

在骨折愈合过程中其他神经肽也参与其中,如血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、神经肽Y(neuropeptide-Y,NPY)、P物质(substance-P,SP)等。VIP和SP均有明显的扩血管作用,通过调节血管的功能而加速骨折愈合。破骨细胞含有神经激肽-1受体,SP通过与神经激肽-1受体结合,激活RANK-RANKL信号通路,调节破骨细胞的骨吸收作用[24]。也有研究表明,SP能剂量依赖性地刺激成骨,低浓度SP可刺激骨髓基质细胞表达ALP、OC以及上调Runx2蛋白的表达;高浓度SP能促进骨细胞的矿化同时还能促进骨吸收,其作用强度比CGRP弱[25]。大量实验结果均显示中枢神经系统损伤后骨痂内神经肽分泌增加,推测可能是中枢神经系统损伤后,上行系统对周围神经抑制减弱,使骨折处感觉神经纤维释放神经肽增加,从而刺激骨痂和软骨痂大量形成[26]。综上,TBI后神经肽可通过调节成骨细胞和破骨细胞的平衡以及血管的生成来加速骨折愈合。

4 TBI后巨噬细胞对骨折愈合的影响

以往的研究认为骨的愈合只涉及成骨细胞和破骨细胞,但是目前许多研究表明免疫细胞对骨的形成、修复和重塑至关重要,成骨与破骨过程会和免疫细胞通过两者共有的通路来相互调节,其中巨噬细胞成为骨免疫学研究的热点。在炎症反应中,巨噬细胞具有吞噬坏死组织和异物的功能,对促进组织愈合起重要作用。巨噬细胞分为两种表型,促炎型(M1)和抗炎型(M2),M1巨噬细胞可分泌白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)、IL-4、肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子来促进炎症,同时也增强了M1巨噬细胞的吞噬功能,加速坏死组织清除,但若巨噬细胞长期处于M1,会加重组织损伤[27];M2巨噬细胞分泌抗炎因子,还能促进细胞增殖、迁移、组织重塑、生长因子的分泌以及间充质干细胞介导的成骨作用[28]。Schlundt等[27]研究发现骨折愈合对巨噬细胞有独特依赖作用,依赖于M1向M2的转化,M1巨噬细胞可抑制成骨细胞分化,而M2巨噬细胞可表达转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和细胞介素10(interleukin-10,IL-10),抑制破骨细胞形成,支持骨沉淀;他们还发现IL-4和IL-13浸在胶原蛋白支架处,可以使截骨部位骨痂生成及骨再生能力增强,同时发现IL-4和IL-13使巨噬细胞向M2极化[27]。Zhang等[29]的研究证实了TBI合并锁骨骨折组较单纯锁骨骨折组能加速骨折愈合,其骨痂组织的M1巨噬细胞百分比随骨折时间延长呈下降趋势,且该组M2巨噬细胞的百分比随时间延长显著高于单纯锁骨骨折组,同时伴有较大的骨痂体积,认为M2巨噬细胞可能与TBI加速骨折愈合有关。综上,M1与M2巨噬细胞的比例可能是TBI后骨折愈合加速的因素,且早期以M1巨噬细胞为主,逐渐向M2巨噬细胞极化。

5 TBI后激素水平对骨折愈合的影响

TBI后由于内分泌应激反应,机体的激素水平会发生一系列变化,这种变化可能对骨折的愈合产生影响。研究发现TBI中血清瘦素的浓度与骨折处骨痂的体积呈正相关[30]。瘦素可以从两个途径影响骨的代谢过程,一是为瘦素通过调控由下丘脑控制的交感神经冲动来发挥其抑制成骨的作用,二是存在于血清中的瘦素具有促进骨矿化和成骨细胞向骨细胞分化的作用。因此TBI后下丘脑的损伤可能会导致瘦素成骨作用的去抑制,而血脑屏障的破坏使血清中瘦素浓度增加,二者协同使骨折愈合加快[31]。另外在早期TBI合并四肢骨折患者血清中,生长激素、甲状旁腺激素水平会出现明显升高,受伤5周后催乳素水平也会出现显著升高,认为TBI后的这些激素变化与骨折处骨痂形成显著相关[32]。在将TBI大鼠的血清转移到肢体骨折大鼠体内后,发现骨折处骨痂形成增加,骨折愈合加速[33]。通过体外细胞实验发现,与单纯TBI和单纯肢体骨折患者血清相比,伴有TBI的肢体骨折患者的血清对人成骨细胞增殖作用更大,推测可能是TBI后大脑产生成骨诱导因子,而血脑屏障的破坏导致成骨诱导因子被释放入血液循环,从而在局部加速骨折愈合[34]。

6 结论与展望

骨折愈合过程复杂、连续和互相重叠,受到许多病理生理机制的调节。而肢体骨折合并TBI后成骨反应增强,骨折愈合速度加快的机制更加复杂,该结果受到ncRNA、SEMA3A、神经肽、免疫细胞和激素等因素的调节。目前研究较为局限,缺乏整体性的研究以及其中相互作用机制的探索。如何构建一个TBI加速骨折愈合的网络机制图,阐明各种作用机制在其中所发挥的作用,成为未来研究的关键问题。目前对于骨折的治疗方法很多,仍有约10%的患者存在骨折愈合不良或骨不连等情况,探索加速骨折愈合的机制可为骨折尤其是骨不连的治疗提供新的理论依据并作为临床指导。

作者贡献声明：陆安静:文献收集及文章撰写;王庭刚、王瑞烈:写作指导;杨光:文献收集;潘均伟:文章校对;郭国宁:写作指导、文章修改;陆元兰:文章设计和审校、文章修改、经费支持