高内涵成像仪检测生脉饮中的药味对葡萄糖转运蛋白4易位的影响

尹琼,张瀚涛,范春兰,王洪平,张润,林兆洲,赵平

(1.北京同仁堂股份有限公司科学研究所,北京 100079;2.北京中研同仁堂医药研发有限公司,中药复方新药开发国家工程研究中心,北京 100079;3.北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,北京 100079;4.中南民族大学生命科学学院,湖北 武汉 430074)

在血糖正常的高胰岛素状态下,约80%的葡萄糖摄取发生在骨骼肌,是餐后状态下葡萄糖摄取和糖原合成的主要场所[1]。在调节骨骼肌中的葡萄糖摄取(glucose uptake)时,最重要的一步是葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter type 4,GLUT4)进入到细胞中[2]。因此葡萄糖摄取量由细胞膜上的GLUT4的数量决定的。GLUT4是一种高亲和力的葡萄糖转运蛋白,具有12个跨膜结构的蛋白,氨基端和羧基端都位于细胞膜内侧,能够转移并定位在细胞膜上[3],从而促进葡萄糖沿着浓度梯度以胰岛素依赖的方式扩散到肌肉和脂肪细胞。在低胰岛素水平的基础条件下,大部分GLUT4被包装在被称为GLUT4储存囊泡(GLUT4 storage vesicles,GSVs)的胞内膜室中,只有大约5%的转运蛋白位于细胞表面。当胰岛素水平升高时,GSVs转移到质膜,通过胞吐作用与质膜连接和融合。GLUT4在胰岛素作用下转移到质膜后,将增加葡萄糖摄取10～30倍[4]。

胰岛素促进肌肉和脂肪组织充分摄取葡萄糖的作用对维持正常的葡萄糖稳态至关重要。胰岛素诱导的GLUT4向质膜易位受损被认为是胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2DM)发展的初始步骤之一,因此胰岛素诱导的GLUT4易位成为抗糖尿病药物研究的热门目标[4]。目前,利用基于GLUT4易位分析的筛选方法来识别可用于提高葡萄糖清除率、降低血糖或提高胰岛素敏感性的类胰岛素物质的研究正受到广泛关注[5]。

L6成肌细胞株是Yaffe[6]从大鼠大腿肌的原代培养物中分离得到。L6骨骼肌细胞株保留有很多骨骼肌的性质,被用于研究响应胰岛素的葡萄糖代谢反应[7]。通过将人的c-myc 表位插入到GLUT4上,并将此质粒稳定转染到 L6 肌原细胞,形成了L6-GLUT4myc大鼠成肌细胞系,通过检测 myc表位,可方便地用类似 ELISA 的方法测定细胞表面GLUT4 密度[8]。

传统中草药资源已经成为发掘新型抗糖尿病药物的热点;生脉饮由红参、麦冬、五味子组成。其主治范围十分广泛,临床常用于治疗冠心病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等。生脉饮中的3种药材红参、麦冬、五味子也常见于治疗消渴症的各类药方中[9],但是大部分关于这3种药材的研究多集中于使用动物模型来检测对GLUT4的影响[10-12],又或者使用的细胞模型并没有和高内涵成像仪方法结合[13,14],因此不确定是否可用作为筛选模型。

因此本研究将以GLUT4作为药物筛选的一个靶点,并使用L6-GLUT4myc细胞模型,结合高内涵筛选技术对这3种中药的总提取物进行检测,观察这3种中药的总提取物是否可以增加GLUT4易位,以确定此方法是否后续可用于大规模的药物筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞L6-GLUT4myc-eGFP(后续写为L6-GLUT4myc)稳转细胞株来自山东维真生物科技有限公司(中国);L6细胞株来自浙江美森(中国)。

1.1.2 试剂Alpha MEM(α-MEM)培养液、胰酶、双抗(P/S)以及胎牛血清(FBS)均来自Gibco公司(美国);CCK8试剂盒来自普利莱(中国);Myc-Tag抗体(#2272)来自CST公司(美国);胰岛素溶液来自Sigma-Aldrich(美国);山羊抗兔IgG H&L(HRP)预吸附二抗(ab7090)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor 647)预吸附二抗(ab150083)来自Abcam公司(美国);马血清(26050088)来自Gibco公司(美国);OPD 底物片剂(邻苯二胺二盐酸盐,34006)和Thermo PierceTM稳定过氧化物底物缓冲液(10×,34062)均来自Thermo Fisher Scientific公司(美国);葡萄糖(GLU-OX)检测试剂盒(氧化酶法)来自英科新创有限公司(中国)。

1.1.3 仪器超净台来自北京东联哈尔仪器制造有限公司;5% CO2培养箱和离心机均来自美国Thermo Fisher Scientific公司;Operetta CLS高内涵仪器来自美国Perkin Elmer公司,酶标仪EPOCH2来自美国Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养用含有10%胎牛血清以及1%双抗的α-MEM培养基,于37 ℃,5%C02条件下培养L6以及L6-GLUT4myc大鼠骨骼肌细胞。L6和L6-GLUT4myc以3×103种于96孔板;L6-GLUT4myc以6×104种于24孔板。1～2 d后用低血清分化培养基[2%(V/V)马血清和1%(V/V)P/S]替代成肌细胞分化培养基。分化培养基每2 d更换1次。成肌细胞分化后5～7 d内融合形成多核肌管。

1.2.2 CCK8实验细胞活力实验通过CCK8试剂盒进行检验。L6以3×103/孔种于96孔板,24 h培养后,换成分化培养液继续培养3～6 d。红参、麦冬、五味子3种药材打碎后,加入DMSO溶解后超声1 h。之后按照浓度进行配置,药物浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1、2 mg·mL-1。细胞分为对照组和给药组,对照组加入等量的DMSO溶液。给药组加入不同浓度的3种药物。所有组干预24 h后加入CCK8试剂孵育2 h,之后在OD450进行读数,计算细胞增殖活力,并选出合适的药物浓度。

1.2.3 GLUT4myc易位的测定(OPD法)L6-GLUT4myc细胞以6×104/孔种于24孔板后,分化后进行血清饥饿3 h后将细胞分为对照组(无血清培养液),阳性对照组(胰岛素100 nmol·L-1)以及给药组(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3种药物),并孵育30 min。用预冷的含1 mmol·L-1Ca2+和1 mmol·L-1Mg2+的D-PBS清洗后,加入预冷的多聚甲醛溶液固定10 min,用D-PBS清洗一次。加入0.1 mol·L-1的甘氨酸,室温孵育10 min。清洗后加入5%(V/V)山羊血清孵育10 min。4 ℃孵育一抗(1∶200)1 h后,D-PBS清洗3次后,4 ℃孵育二抗IgG H&L(HRP,1∶1 000)1 h。室温洗去多于抗体,加入底物邻苯二胺(OPD,o-phenylenediamine),避光反应30 min,加入3 mol·L-1HCL终止反应。OD492测定上清吸光值,然后减去背景孔的数值后,计算细胞膜上的量,结果表示为相对于对照组的倍数。

1.2.4 免疫荧光检测质膜上GLUT4myc-GFPL6-GLUT4myc细胞以3×103/孔种于96孔板后,分化后进行血清饥饿3 h后将细胞分为对照组(无血清培养液),阳性对照组(胰岛素100 nmol·L-1)以及给药组(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3种药物),并孵育30 min。用PBS清洗后加入4% 多聚甲醛溶液,在冰上固定30 min。之后PBS清洗一次,0.1 mol·L-1的甘氨酸室温孵育15 min。PBS清洗3次,加入5% 山羊血清的封闭液,室温封闭30 min。加入一抗(1∶100),37 ℃孵育1 h,PBS清洗后,加入二抗(山羊抗兔Alexa Fluor 647,1∶1 000)以及DAPI进行孵育,37 ℃ 1 h。最后用PBS清洗干净后,用高内涵仪器进行读数。

1.2.5 葡萄糖摄取实验L6细胞以3×103/孔种于96孔板后,细胞分化后进行血清饥饿3 h后将细胞分为对照组(无血清培养液),阳性对照组(胰岛素100 nmol·L-1)以及给药组(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的3种药物),并孵育30 min。30 min后另取一个新的 96 孔板,按照试剂盒说明书对每孔加入 200 μL 葡萄糖氧化酶试剂,并另取一排加入氧化酶试剂后加入 2 μL 葡萄糖标准蛋白液,从旧 96 孔板中一对一地取上清液 2 μL 加入新板中,随后用酶标仪505 nm测量吸光值,以下公式计算[样本管吸光度(30 min)]/[校准管吸光度(30 min)×校准品中的葡萄糖浓度(mmol·L-1)]来表示葡萄糖浓度(mmol·L-1),葡萄糖浓度的差值即得葡萄糖摄取(消耗率)。

1.2.6 统计分析数据都显示为平均值±标准差(mean±SD)。数据采用单因素方差分析进行评估。采用Bonferroni多重比较检验评估平均值之间的差异。使用了SPSS和Graph Pad Prism软件进行统计结果分析,P<0.05被认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 24 h不同浓度药物对细胞损伤效果为了避免过高的浓度引起细胞死亡,我们使用CCK8法对3种药物的总提取物的给药时间和浓度进行检测。结果显示在干预24 h后,相较于正常组 ,当浓度低于0.1 mg·mL-1时,除了五味子,麦冬和红参均不会影响细胞活性。而3种药物总提取物浓度从0.2 mg·mL-1到 2 mg·mL-1都显著地降低了细胞活性,因此不予考虑(见图1A)。为进一步检测合适的浓度,在0到0.1 mg·mL-1浓度中设置了两个低浓度组,为0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1(10 μg·mL-1和50 μg·mL-1)。相较于正常组,当3种药物总提取物浓度在0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1浓度时,细胞活性均无影响(见图1B)。因此后续实验每种药物都将使用0.01 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1的浓度。

A.24 h不同浓度的3种药物对L6细胞的损伤效果;B.24 h低剂量浓度的3种药物对L6细胞的损伤情况

2.2 3种中药单体对L6细胞葡萄糖摄取的影响为了验证3种中药提取物可能的降糖活性,我们首先研究了它们的葡萄糖摄取效果。L6细胞经过血清饥饿后,加入胰岛素(100 nmol·L-1)和不同浓度的3种药物总提取物孵育30 min后进行检测,结果如图2显示(L6细胞以3×103/孔种于96孔板后,分化后进行血清饥饿3 h,加入胰岛素100 nmol·L-1以及不同浓度药物孵育30 min)。胰岛素作为阳性对照显著地促进了L6肌细胞的葡萄糖摄取,说明选择的系统和构建的模型成功。与正常组(Control)相比,麦冬总提取物在10 μg·mL-1与50 μg·mL-1的平均葡萄糖摄取率为(2.01±0.11)倍与(2.10±0.17)倍(P<0.05)。红参总提取物在10 μg·mL-1和 50 μg·mL-1的平均摄取率分别为(1.66±0.08)和(1.67±0.16)倍(P<0.05)。麦冬和红参总提取物都显著增加了细胞的葡萄糖摄取,而五味子的总提取物只有在10 μg·mL-1时提高了葡萄糖摄取率,50 μg·mL-1的与正常组相比并没有显著区别。

图2 3种药物总提取物的葡萄糖摄取实验结果

2.3 OPD法测定细胞膜上GLUT4myc为了探讨3种药物总提取物诱导L6肌细胞葡萄糖摄取增加的机制,我们通过OPD法检测了它们的总提取物对L6-GLUT4myc 细胞中GLUT4的易位效果。如图3结果显示与正常组(Control)相比,胰岛素组(Insulin,100 nmol·L-1)明显增加了细胞膜表面GLUT4-myc的数量(2.19倍,P<0.001),证明实验体系是成功的。麦冬、五味子、红参的总提取物在10 μg·mL-1下刺激L6-GLUT4myc肌管细胞膜表面GLUT4myc的数量为基础状态(正常组)的(1.32±0.08)、(1.66±0.12)、(1.60±0.07)倍(P<0.05)。这3种药物的总提取物增加GLUT4myc的倍数基本相似,但水平都低于胰岛素组。而在50 μg·mL-1浓度时,麦冬和红参增加的倍数为(1.56±0.07)和(1.61±0.05)(P<0.05)。而五味子在50 μg·mL-1时并不能刺激GLUT4myc的易位。此实验表明,3种药物仅在低浓度(10 μg·mL-1)时显著地刺激了L6-GLUT4myc肌管GLUT4myc易位,而在高浓度时(50 μg·mL-1)只有麦冬和红参刺激了GLUT4myc易位。

图3 OPD法检测GLUT4-myc易位

2.4 高内涵仪器检测L6细胞内GLUT4的易位由于细胞内GLUT4易位到细胞表面可以发挥葡萄糖摄取功能,我们结合高内涵成像仪(免疫荧光法)进一步分析了3种药物提取物处理下L6细胞的GLUT4易位。如图4A显示,高内涵成像仪检测的结果基本和OPD法相似。其中胰岛素显著增加了GLUT4-myc的表达为(1.40±0.06)(P<0.05)。红参和麦冬的总提取物在10 μg·mL-1和50 μg·mL-1时都增加了GLUT4-myc的易位(P<0.05)。同OPD法,五味子仅在10 μg·mL-1的浓度下增加GLUT4-myc的易位(P<0.05)。图4B显示的是细胞膜上GLUT4myc-GFP的情况,如图4所示,红参和麦冬50 μg·mL-1以及胰岛素的荧光强度明显较强。

3 讨论

葡萄糖转运蛋白4 是抗糖尿病的靶点之一,其在肌肉和脂肪组织中广泛分布,是维系机体血糖平衡的关键因子。基GLUT4研发新一代抗糖尿病药物已成为研究热点,中草药资源也已经成为发掘新型抗糖尿病药物的热点。红参、麦冬、五味子作为治疗消渴症常见中药,大部分的研究都集中于动物体上,对于应用在体外的筛选模型的相关研究非常少。本实验通过使用高内涵成像仪检测了3种中药的提取物对GLUT4易位的效果。在L6-GLUT4myc的细胞模型上证明了红参、麦冬、以及五味子的总提取物均增加了葡萄糖代谢和GLUT4的易位。此外,本实验也证明L6-GLUT4myc细胞株是可用于研究葡萄糖摄取和 GLUT4 易位的细胞模型,在结合高内涵仪器检测后,可以进行高通量(96孔板或者384孔板)的半定量和定性的结果统计,并用于研究新型抗糖尿病药物的筛选。

葡萄糖摄取的量是由肌细胞膜上GLUT4分子的数量决定的,因此检测葡萄糖摄取量的多少也从侧面反映了细胞膜上GLUT4的数量。在本研究中葡萄糖摄取的结果显示麦冬和红参的提取物都刺激了肌细胞摄取葡萄糖,而五味子只在低浓度下加速了葡萄糖摄取。此结果与高内涵仪器检测的细胞膜表面GLUT4的数量的结果相匹配,证明高内涵检测GLUT4易位是可行的。

红参是经高温处理过的人参,多年前就用于降血糖的辅助治疗。文献显示在肥胖造成胰岛素抵抗的SD大鼠实验中,红参可能通过增加IR-b、IRS-1、Akt和GSK3a/b的磷酸化,以及增加骨骼肌中GLUT4的易位来提高胰岛素敏感性,从而在产生抗糖尿病和抗肥胖作用[15]。Kim等[16]研究亦发现由果胶裂解酶修饰的红参提取物GS-E3D可增加肥胖小鼠模型里GLUT4的表达以及易位,并改善脂肪外膜外组织的胰岛素敏感性及与肥胖相关的糖耐量受损。这些研究均指出红参通过增加GLUT4易位并改善胰岛素敏感性。麦冬具有抗糖尿病、保护心血管、增强免疫力、抗炎、抗肿瘤等药理作用[17]。在胰岛素抵抗的L6细胞中,麦冬多糖给药后细胞葡萄糖消耗量显著上升,并可显著增强IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白水平和GLUT4蛋白水平,表明麦冬多糖可通过增强IRS-1酪氨酸磷酸化和GLUT4蛋白表达来增强胰岛素抵抗L6细胞葡萄糖摄取能力[13]。五味子具有敛肺滋肾、生津敛汗、宁心安神的作用,常用于治疗肺肾阴虚、津伤口渴等证。在临床实践过程中,人们发现五味子化治疗糖尿病尤其是2型糖尿病方面有一定的疗效[18]。相较于红参和麦冬,五味子针对GLUT4易位方面的研究非常少,仅有的研究提到从五味子中提取的低分子量多糖可上调肝源性成纤维细胞(水牛大鼠肝)中GLUT4的表达,并改善葡萄糖摄取[19]。此外五味子的提取物可以增加3T3-L1细胞的葡萄糖摄取[20]。根据文献中体内外研究的结果可以证实,红参、麦冬、五味子确实有增加GLUT4易位的效果,而在本研究中,证明了红参、麦冬、五味子的总提取物在体外肌细胞模型L6-GLUT4myc中,同样可以增加GLUT4的易位和葡萄糖摄取。此外,实验结果也展示了L6-GLUT4myc细胞株可以作为体外研究工具并结合高内涵成像仪用以筛选影响GLUT4易位的中药或者单体。

自几十年前发现胰岛素刺激体内葡萄糖转运以来,了解胰岛素作用的分子机制一直是人们关注的焦点。早期检测GLUT4易位到质膜的生化方法包括Western blot分析或细胞松弛素B结合分析[21]、免疫沉淀[22]、流式细胞术[23]等技术。每一种方法都有自己的优点和局限性,但是大多数方法都包含不止一个步骤,比较耗时和费力,并且存在方法学上的不准确性。OPD法是一种快速检测细胞中 GLUT4 易位的简单方法,并且具有高灵敏度,该方法可以准确计算细胞表面 GLUT4 分子的数量[9]。这种免疫学测定法经常用于稳定表达myc标记的GLUT4的细胞,并成为现在最常用的检测方法之一[24-25]。然而,该方法包括许多洗涤、结合和孵育步骤,因此使得此方法耗时、费力且容易出错。此外,由于第二抗体的非特异性结合和交叉反应,酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)容易出现假阳性或假阴性结果[26]。

近年来,随着高通量技术的发展,高内涵技术也被用于细胞生物学实验,使得大规模细胞生物学研究成为可能。高内涵技术即高内涵筛选(high content screening,HCS)是一种结合了细胞生物学的分子工具和自动高分辨率显微镜及自动分析功能的活细胞成像技术[27]。在保持细胞结构完整性的条件下,通过活细胞成像、荧光探针等技术同时监测被筛选药品对细胞生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等多个环境的影响,涉及膜受体、胞内成分、细胞器和离子通道等众多靶点,从而能够得到多方面的筛选结果[28]。在本研究中,结合L6-GLUT4myc细胞系,我们使用了高内涵检测GLUT4的易位,其结果与OPD法的结果相似,并且与葡萄糖摄取的结果也保持一致。相较于OPD法使用24孔板进行检测,高内涵检测可对96孔板或者更多孔板(384)进行检测,适合用于大规模的药物筛选,而且结果具有可视化的优点。但不同于OPD法可以进行定量检测,高内涵仪器只能对结果进行半定量检测。从步骤和时间上来看,高内涵检测法省去了最后OPD孵育的时间,步骤和时间稍少于OPD法。从计算结果上看,OPD需要通过酶标仪读数后,在使用EXCEL等软件进行计算,而高内涵检测仪器配备的软件(Harmony软件,PE),可以在图形读取后就进行计算,节省了时间。

综上所述,红参、麦冬、五味子作为常用治疗消渴症的药物均有增加GLUT4易位和葡萄糖摄取的效果,其中麦冬,红参总提取物在低剂量(10 μg·mL-1)和高剂量(50 μg·mL-1)均有效果,而五味子总提取物只在低剂量(10 μg·mL-1)有效果。这可能就是3种药物可以用于治疗消渴症的可能的机制之一。研究结果还显示L6-GLUT4myc是可用于研究葡萄糖摄取和 GLUT4 易位的细胞模型,并且与高内涵检测仪可以搭配以用于新型抗糖尿病药物的筛选,为之后使用高内涵成像仪筛选刺激GLUT4易位的药物或单体成分提供了研究基础,也进一步为中药对于治疗糖尿病的可行性机制提供了研究思路。