肉桂精油复合壳聚糖乳液对采后芒果炭疽病的防治效果及作用机制
2023-08-14方静谷会姚全胜杜丽清
方静 谷会 姚全胜 杜丽清
摘 要:芒果风味独特、营养丰富,被誉为“热带果王”,但芒果在采后后熟过程中极易腐烂变质,其中由炭疽病引起的腐烂损失最为严重。因此,如何防治芒果采后炭疽病,成为制约芒果产业健康发展的瓶颈问题。以台农1 号芒果为试材,研究绿色环保的肉桂精油复合壳聚糖乳液对采后芒果炭疽病的防治效果及作用机制。研究结果表明:0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理对芒果炭疽病的防治效果最好,0.03%肉桂精油处理可完全抑制离体芒果炭疽菌的生长和产孢,0.01%、0.02%肉桂精油处理对芒果炭疽菌菌丝有明显的破坏作用;复合处理显著抑制了芒果炭疽病病斑的扩大,提高了抗病相关物质木质素、总酚(TP)和过氧化氢(H2O2)的含量,提高了抗病相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA)、几丁质酶(CHI)的活性。由此可见,肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果炭疽病有较好的防治效果,一方面是由于复合处理抑制或破坏了芒果炭疽菌菌丝的生长和产孢,另一方面是复合处理诱导芒果果实提高了抗病性。因此,适宜浓度的肉桂精油复合壳聚糖乳液处理为防治芒果采后炭疽病提供了一种绿色新途径,研究结果可为我国芒果采后贮运保鲜产业的发展提供理论依据和应用参考。
关键词:芒果;炭疽病;肉桂精油;壳聚糖;防治效果
中图分类号:TS255.3 文献标识码:A
芒果(Mangifera indica L.)属漆树科芒果属植物,因果实营养丰富,风味独特,含有丰富的碳水化合物、糖、蛋白质、维生素及微量元素,被誉为“热带果王”[1]。芒果在高温多雨季节采收,果实中水分含量较高,在采后极易受到病原菌侵袭引起腐烂变质,严重影响果实的商品货架期[2]。
目前,用于芒果保鲜的方法主要有物理保鲜和化学保鲜,物理保鲜的方法主要有热处理、低温贮藏、气调贮藏等,但物理保鲜需要特殊的设备,成本高,难以在生产中推广应用;化学保鲜的方法主要有杀菌剂、抗生素和激素等,但化学保鲜会有药剂残留,对人体健康存在潜在的危害,并对环境造成不良影响[3-4],随着人们食品安全意识的逐渐增强,以及持续用药导致病原菌的耐药性提高,杀菌剂的药效不断降低[5-6]。因此,急需研发一些安全高效、绿色环保、易推广应用的芒果采后炭疽病防治方法。
壳聚糖(chitosan, CTS)是从虾、蟹、昆虫等低等动物和菌、藻类等动植物为原料提取出来的一种天然高分子化合物,因其具有无毒、成膜性好、抗菌性能广、对气体有选择渗透性等优点,已广泛应用于水果涂膜保鲜,可为水果提供良好的气调微环境, 减少气体交换, 延缓果实成熟[7]。已有研究表明,壳聚糖在甜瓜[8]、桃[9]、猕猴桃[10]等果实上具有良好的保鲜效果。然而,壳聚糖单独使用作为涂膜保鲜剂仍具有一定的局限性,由于亲水性基团的存在,强度、韧性不够,机械性能较差,一段时间后涂膜易断裂破碎,壳聚糖的抑菌性能也有限,不能很好地应用于果蔬保鲜。为了进一步提高壳聚糖的成膜性和抑菌性,通常会加入一些植物精油,在果实上涂膜形成可食用性薄膜。
肉桂精油作为天然提取物的植物精油,具有挥发性,无毒无害,因其具有良好的抗氧化性和抗菌活性,成为果蔬保鲜的研究热点。肉桂精油和壳聚糖联合使用可以提高单一壳聚糖涂膜的水汽渗透性能,增加其结构的稳定性,在果实表面形成一个高CO2、低O2 的微环境,减少肉桂精油的蒸气扩散和损失,能够更好地抑制微生物生长和保持果实的贮藏品质。MA 等[11]研究发现,哈密瓜在21 ℃下贮藏14 d,1%壳聚糖和1%肉桂精油复合涂膜对病原菌和微生物的抑制效果最好。XING 等[12]利用1%壳聚糖复合0.25%肉桂精油涂膜处理甜椒,在8 ℃下贮藏35 d 后,甜椒的病情指数低于5%。BASAGLIA 等[13]利用2%壳聚糖复合0.5%肉桂精油对鲜切菠萝进行涂膜处理,能够明显抑制病原菌的生长。黄文佳[14]研究发现,0.5%壳聚糖复合0.3%肉桂精油对番木瓜炭疽病的防治效果最好,在25 ℃下貯藏15 d 后的防治效果为92.5%。赵亚珠等[15]研究发现,用肉桂精油和壳聚糖等材料制备抗菌纸,可明显抑制甜樱桃病原真菌的生长,降低腐烂率。
可见,肉桂精油和壳聚糖复合处理在采后果蔬上有明显的抗病及保鲜效果,但肉桂精油和壳聚糖复合处理在芒果保鲜上的应用鲜有报道,本研究以此为切入点,探索肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果炭疽菌的防治效果以及相关作用机制,为芒果采后贮运保鲜产业发展提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试品种 台农1 号芒果(Mangiferaindica L. Tainong No.1),采收成熟度为七八分熟果实,留约12 cm 果柄,挑选大小均匀、表面光滑、无病虫害、无机械损伤的果实,采后立即运回中国热带农业科学院南亚热带作物研究所采后保鲜实验室进行处理。
1.1.2 化 学 试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),广东环凯微生物技术有限公司;壳聚糖(低粘度<200 mpa·s,分析纯),上海阿拉丁生化科技有限公司;吐温80,上海麦克林生化科技有限公司;肉桂精油,陕西森朗生物化工有限公司;冰醋酸(分析纯),天津市江天化工技术有限公司;纤维素纳米纤维,开翊新材料科技(上海)有限公司。
1.1.3 供试菌株 芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides Penz.),由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所采后保鲜实验室分离纯化。
1.1.4 主要仪器设备 RCT 型加热磁力搅拌器,德国IKA 公司;T25 型剪切分散乳化机,德国IKA公司;THZ-98C 型霉菌培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;ZRD-A5210 型电热烘箱,上海智城分析仪器制造有限公司;Axiolmager M2 型全自动研究级生物显微镜,德国ZEISS 公司;902GP型超低温冰箱,美国Thermo Fisher 公司;MIR-553低温恒温培养箱,日本三洋电机株式会社。
1.2 方法
1.2.1 肉桂精油壳聚糖复合乳液的制备 将壳聚糖加入0.5%冰醋酸溶液后, 在磁力搅拌器1000 r/min 转速下搅拌,使壳聚糖完全溶解,壳聚糖溶液的浓度为0.3%,之后依次加入0.1%纤维素纳米纤维和肉桂精油,用锡箔纸包裹,在不透光条件下用磁力搅拌器搅拌,再用10 000 r/min剪切分散乳化机搅拌2 min,直至液体完全乳化,静置,待泡沫消失后备用。
1.2.2 复合乳液对芒果炭疽病的防治效果 将挑选好的芒果随机分为1 个对照组和4 个处理组。
处理组分别为:0.7%肉桂精油+0.3%壳聚糖、0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖、0.3%肉桂精油+0.3%壳聚糖、0.3%壳聚糖,喷雾处理果实表面,以清水处理为对照,自然晾干后套袋,置于22 ℃贮藏,24 h后取出芒果果实,用针刺接种法接种,在每个芒果果面靠近两端处刺出2 个接种点,接种直径为5 mm 的炭疽菌菌块,用棉块保湿,之后将果实装入厚度为0.03 mm 的PE 保鲜袋,放入恒温箱22 ℃培养,24 h 后去除菌块,每隔3 d 用十字交叉法测定病斑直径,每处理8 个果实,3 次重复。
芒果发病程度参照曾凯芳等[16]的方法,稍加改进,根据果实表面病斑面积分为0~4 等级,分级标准:0 级(病斑面积>50%);1 级(病斑面积20%~50%);2 级(病斑面积10%~20%);3 级(病斑面积<10%);4 级(无病斑)。病情指数=Σ(发病等级×病害果数)/(发病最高级值×总果数)×100;防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。
1.2.3 肉桂精油对芒果炭疽菌菌丝生长和产孢的影响 制作PDA 平板,其中处理组PDA 平板中分别含有0.005%肉桂精油、0.01%肉桂精油、0.015%肉桂精油、0.02%肉桂精油、0.025%肉桂精油、0.03%肉桂精油,空白PDA 平板为对照。
取提前培养好的芒果炭疽菌平板,在菌落边缘打取直径为5 mm 的菌块,接种到含肉桂精油的PDA 平板中央,28 ℃恒温培养,用十字交叉法每天测量炭疽菌菌落直径,并在培养7 d 后用血球计数板计量每个培养皿的产孢量,重复3 次。
1.2.4 菌丝形态结构观察 含肉桂精油的PDA平板制作方法同1.2.3,用镊子将无菌盖玻片以45°角斜插入PDA 平板培养基中,并在平板上放入菌块,菌块与插片的间距为1.0~1.5 cm,每皿插入2 排2 列载玻片,倒置放入28 ℃恒温培养箱培养,7 d 后取出附有炭疽菌菌丝的载玻片,用擦镜纸擦去载玻片背面的菌丝和培养基,置于显微镜下进行观察记录。
1.2.5 芒果果实抗病相关物质含量和抗病相关酶活性的测定 芒果果实处理方法同1.2.2,处理组为0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖,清水处理为对照,分别在采后0、3、6、9、12、15 d 時取样,取样部位为果实病健交界处的果皮组织,每处理6 个果实,重复3 次。木质素含量、总酚(TP)含量、过氧化氢(H2O2)含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA)、几丁质酶(CHI)活性均采用苏州科铭生物技术有限公司生产的试剂盒进行测定。
1.3 数据处理
采用Excel 2010 软件统计试验数据,计算平均值和标准误差并制图;采用SPSS 22.0 软件进行方差分析(ANOVA),利用Duncan’s 多重比较分析显著性差异(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果炭疽病的防治效果
由图1 可知,对照组在贮藏第6 天开始发病,各处理组在贮藏第9 天开始发病,各处理组的病情指数明显低于对照组,在贮藏第12、15 天时,0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖的病情指数显著低于其他处理组(P<0.05),在贮藏第15 天时,0.7%肉桂精油+0.3%壳聚糖、0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖、0.3%肉桂精油+0.3%壳聚糖和0.3%壳聚糖处理组的防治效果分别为15.25%、22.03%、13.56%、10.17%,其中以0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理组的防治效果最好,因此后续试验采用该组合处理。
2.2 肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果炭疽病病斑直径的影响
由图2 可知,从贮藏第6 天开始,处理组的炭疽病病斑直径均显著低于对照组,其中以0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理的效果最佳,在贮藏6、9、12、15 d 时,0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理的病斑直径分别为8.25、12.25、18.81、30.50 mm,分别比对照组低33.03%、26.60%、22.85%、24.22%。
2.3 肉桂精油对芒果炭疽菌菌丝生长和产孢的影响
由表1 可知,芒果炭疽菌在含有不同浓度肉桂精油的平板上培养7 d 后,处理组的菌落直径均显著小于对照(P<0.05),随着精油浓度的增加,菌落抑制率逐渐增大,精油浓度为0.03%时的菌落抑制率为100.00%,说明肉桂精油的最低抑菌浓度为0.03%。肉桂精油促进芒果炭疽菌产孢,其中0.015%肉桂精油处理的产孢最多,0.005%、0.01%、0.02%肉桂精油处理的产孢量也显著高于对照(P<0.05),0.03%肉桂精油完全抑制产孢。
2.4 肉桂精油对芒果炭疽菌菌丝形态的影响
图3 表明,肉桂精油可明显抑制芒果炭疽菌菌丝的生长。通过低倍镜发现,对照组菌丝生长浓密,细胞形态规则,长势良好(图3A);通过高倍镜发现,菌丝内含物丰富,菌丝饱满、细长,表面光滑、粗细均匀(图3B)。经肉桂精油处理后,菌丝生长稀疏、分叉、断裂变短,细胞内陷,内含物外泄,菌丝有缺口(图3C);随着肉桂精油浓度加大,菌丝变形程度和范围加大,表现为菌丝断裂(图3D)。
2.5 肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果抗病相关物质的影响
由图4A 可知,在芒果贮藏过程中,对照组与0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理组果皮的木质素含量的变化趋势基本一致,整体呈先上升后略下降的趋势,在贮藏后期处理组的木质素含量显著高于对照组(P<0.05)。由图4B 可知,对照组和0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理组的芒果果皮H2O2 含量均呈先上升后略下降的趋势,处理组在前6 d 缓慢上升,与对照组差别不大,在第6 天后迅速上升,在12 d 时达到最大值53.0 mol/g,处理组在第9 天后H2O2 含量显著高于对照组(P<0.05)。由图4C 可知,0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理组的果皮总酚含量在前3 d 稍有下降,随后呈直线上升趋势,且在贮藏第6 天后,处理组的总酚含量显著高于对照组(P<0.05)。
2.6 肉桂精油复合壳聚糖乳液对芒果抗病相关酶的影响
由图5 可知,在整个贮藏期间,0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理组的果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)、β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA)、几丁质酶(CHI)活性均显著高于对照组(P<0.05)。PAL活性在贮藏3 d 后迅速上升,在9 d 时达到最高峰627.45 U/g,比对照组高37.8%;处理组和对照组β-1,3-GA 活性均在第6 天达到最高峰,处理组最高峰值为75.41 U/g,比对照组高36.0%;CHI 活性在前3 d 无显著差异,但处理组在3 d 后迅速上升,在第6~15 天一直保持较高水平,明显高于对照(P<0.05)。在贮藏前期0.5%肉桂精油+ 0.3%壳聚糖处理组的过氧化物酶(POD)活性低于对照,但在贮藏6 d 后迅速上升,在贮藏9 d 后一直保持着较高水平,明显高于对照(P<0.05)。
3 讨论
不同浓度肉桂精油复合壳聚糖乳液对采后芒果炭疽病均有一定的防治效果。其中,0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理后的防治效果最佳,0.7%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理和0.3%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理的防治效果显著低于0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理,这是由于0.7%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理后的芒果果面出现了灼伤现象,可能是精油浓度偏高损坏了芒果果皮而降低了抗病性,而0.3%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理则浓度偏低,不能获得较好的抗病效果。肉桂精油的抑菌机理主要是其中的反式肉桂醛可破坏细胞膜,使内含物外渗,阻碍菌体能量代谢过程,从而抑制孢子萌发、菌丝正常生长发育[17]。蒋帅[18]研究发现,0.01%肉桂精油在离体条件下对灰葡萄孢生长的抑制率达96.85%。毛雪琳[19]研究发现,0.04%肉桂精油对巨峰葡萄黑曲霉菌、青霉菌、灰霉菌具有良好的抑制作用。何靖柳[20]研究发现,0.02%
肉桂精油对猕猴桃尖孢炭疽菌和葡萄座腔菌有良好的抑制作用。本研究發现,0.03%肉桂精油可完全抑制炭疽菌菌丝生长和产孢,0.02%、0.015%、0.01%、0.005%肉桂精油均在一定程度上抑制菌丝生长,反而促进产孢,可能是精油给病原菌生长造成逆境而促进产孢。不同浓度的肉桂精油均可使芒果炭疽菌的菌丝形态发生变化,使菌丝内含物外渗,干扰并抑制病原菌的营养生长,且浓度越大对芒果炭疽菌的破坏越大,这与肉桂精油对葡萄病原菌的抑制情况一致[19]。
木质素、总酚、H2O2 是重要的抗病相关物质,木质素是植物细胞壁的主要成分,木质素含量的提高可加强对病原菌侵入细胞的抵御;总酚具有较强的抗菌性,可以直接或间接杀死病原菌,从而抑制其扩散[21];弓德强等[22]研究了芒果采后抗病性与木质素和总酚含量的关系,发现芒果果实抗病性的提高与抗性物质木质素和总酚密切相关。刘淑宇[23]研究发现,芒果采后抗病性的提高与总酚、木质素含量的增加有关。本研究中木质素和总酚含量的提高,可能与果实采后防御酶活性如PAL、POD 活性的提高密切相关。H2O2 作为一种活性氧,不仅可直接杀死病原菌,还是一种扩散的小分子,可作为第二信使激活防卫基因的表达,最终导致病原菌产生抗性[24]。王近近等[25]研究发现,茶树精油可使灰葡萄孢霉菌丝体内大量积累H2O2,增加病菌的细胞膜通透性,破坏菌体结构进而发挥抑制作用。陈晓晶等[26]研究了香茅精油对番木瓜炭疽病的诱导抗病机制,发现H2O2 含量的升高可明显提升番木瓜的诱导抗病性。本研究也得到相似结果,在芒果贮藏12 d 后,H2O2 含量达到最大值,同时木质素和总酚含量也达到较高水平,可能是0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖复合处理后,H2O2 作为信号分子参与了芒果果实内的抗病信号传导,诱导了抗病防御系统的启动。
苯丙烷代谢是果实体内重要的次生代谢途径,具有杀菌、抗病毒、清除自由基等多种生物活性,参与果实的防御反应。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、β-1,3 葡聚糖酶(β-1,3-GA)、几丁质酶(CHI)都是重要的抗病相关酶,其中PAL 是苯丙烷代谢的首要关键酶,参与由多途径激发子诱导植物的抗病反应,增强植物对不良因子的抵御,是酚类、类黄酮、木质素等合成的关键限速酶;POD 在植物体内参与酚类物质的合成,调节植物代谢过程中的活性氧,是植物组织内抗性物质合成的关键酶;CHI 和β-1,3-GA 是植物体内2 种最重要的病程相关蛋白,分别通过降解病原菌细胞壁的几丁质和β-1,3葡聚糖而破坏病原菌的细胞结构[27]。肉桂精油和壳聚糖复合处理能提高果蔬采后抗病性已有较多报道,如黄文佳等[28]用肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜进行处理,发现番木瓜抗病机制与提高抗病相关酶PAL、POD、β-1,3-GA 的活性呈正相关;蒋帅[18]研究发现,肉桂精油结合壳聚糖处理提高抗病性与PAL、POD 活性的升高有密切关系;郭欣等[29]研究发现壳聚糖处理可增加西番莲果皮抗病相关酶PAL、POD、CHI、β-1,3-GA 的活性,从而增强西番莲果实的抗病性。这与本研究结果相契合。
綜上所述,不同浓度肉桂精油复合壳聚糖乳液处理对芒果炭疽病均有一定程度的抑制效果,其中以0.5%肉桂精油+0.3%壳聚糖处理效果最好,在贮藏第15 天时的防治效果为22.03%。抗病相关机制主要有2 方面,一方面是肉桂精油抑制或破坏了芒果炭疽菌菌丝生长;另一方面是肉桂精油复合壳聚糖处理提高了抗病相关物质木质素、H2O2、总酚的含量,增强了抗病相关酶PAL、POD、β-1,3-GA、CHI 的活性,从而诱导芒果果实提高抗病性。
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