番木瓜籽挥发油纳米结构脂质载体的制备及抗假丝酵母菌活性研究

姚凯 马寅正 易国辉 王元晓 周霞 臧旭 刘禹棋 汪桐 何小稳

摘 要：番木瓜（Carica papaya Linn.）属十字花目番木瓜科，广泛分布于热带、亚热带地区。课题组前期研究发现，番木瓜籽挥发油的主成分为异硫氰酸苄酯（BITC），含量高达99%，具有天然、无污染、纯度高等特点，且对多种假丝酵母菌均具有明显的抑制作用。但由于BITC 水溶性差、易挥发、易降解等缺点，限制了其应用。本研究采用熔融乳化超声法制备异硫氰酸苄酯纳米结构脂质载体（BITC-NLC），并进行形态、粒径及Zeta 电位、包封率、载药量等方面的表征及其抗假丝酵母菌活性研究，旨在提高BITC 的稳定性和抑菌效果。在单因素试验基础上通过正交试验设计，优化纳米结构脂质载体（NLC）的制备工艺和BITC-NLC 的处方组成，得到最佳制备工艺：初乳搅拌20 min，超声分散15 min（振幅80%）；最佳处方组成：单硬脂酸甘油酯50 mg，辛癸酸三甘油酯50 mg，聚醚F188 400 mg，大豆卵磷脂400 mg，BITC 100 mg，蒸馏水20 mL。采用透射电子显微镜观察形态，纳米粒度及Zeta 电位测定仪测定粒径及Zeta电位，高效液相色谱法测定包封率和载药量。最终制备得到的BITC-NLC 呈类球形，平均粒径为79.13 nm，Zeta 电位为–21.77 mV，包封率为91.52%。初步稳定性试验结果显示，BITC-NLC 在25 ℃下贮存30 d 的稳定性良好。采用微量稀释法测得制剂对供试白假丝酵母菌（Candida albicans）和热带假丝酵母菌（C. tropicalis）的最低抑菌浓度（MIC）为8～32 μg/mL，比原料药BITC 的抑菌效果好，且对耐药菌株也具有抑菌效果。综上，本研究制备的番木瓜籽挥发油新剂型BITC-NLC 粒径小，稳定性好，包封率高，对假丝酵母菌抑制作用强，为大量存在且多被丢弃的番木瓜籽的合理开发和综合应用提供依据。

关键词：番木瓜籽；挥发油；异硫氰酸苄酯；纳米结构脂质载体；假丝酵母菌

中图分类号：R284；S59 文献标识码：A

番木瓜（Carica papaya L.）属十字花目番木瓜科，广泛栽培于热带、亚热带地区，在中国主要分布在海南、广东、广西、福建、台湾等地，海南岛产量丰富，其果实药食两用，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性[1-2]。番木瓜籽是果实加工的副产物，研究番木瓜籽成分及活性对其合理开发利用具有重要意义[1-6]。课题组前期研究发现，番木瓜籽挥发油的主成分为异硫氰酸苄酯（benzyl isothiocyanate， BITC），含量高达99%，具有天然、无污染、纯度高等特点，且对多种假丝酵母菌（包括耐药菌）均具有明显的抑制作用[7-8]。

近年来，以假丝酵母菌为代表的侵袭性真菌感染呈逐年上升趋势，尤其是对免疫功能低下的患者，其发病率和死亡率高，而假丝酵母菌对常用抗真菌药物的耐药性日益提升，成为临床治疗失败的重要原因[9-10]。白假丝酵母菌（Candida albicans，Ca）是引起假丝酵母菌感染的主要种群，但在热带及亚热带地区，热带假丝酵母菌（C. tropicalis，Ct）已成为仅次于白假丝酵母菌的第二大假丝酵母菌[11]，因此加快新型抗真菌药物的研制和开发具有重要意义[12-14]。但由于BITC 难溶于水、易挥发、不稳定，限制了其在医药、食品等各领域的应用。纳米结构脂质载体（nanostructured lipidcarriers， NLC）作为一种新型的纳米制剂，是以固液态混合脂质材料为载体，可保护挥发油免受外界环境的影响， 形成的纳米制剂粒径直径在10～1000 nm 范围的药物传送系统，可增加其稳定性、避免降解或泄露，具有良好的缓控释作用及靶向性，且可提高其抗菌活性[15-18]。

本研究拟采用熔融乳化超声分散法制备番木瓜籽提取物異硫氰酸苄酯-纳米结构脂质载体（BITC-NLC），先通过单因素试验考察确定影响制剂制备工艺和处方组成的主要因素，再采用正交试验方法进行优化，从而制备得到BITC-NLC，以解决BITC 在贮藏过程中对光、热、氧的不稳定性以及易挥发、低水溶性等缺点，从形态、粒径及分布、Zeta 电位、包封率、载药量等方面对制剂进行初步表征和评价， 并研究比较BITC-NLC 与BITC 对假丝酵母菌Ca 和Ct 抗菌活性的差异，探讨BITC-NLC 的应用前景，制备得到的天然抗真菌新剂型，为番木瓜籽的合理开发和综合应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

番木瓜籽挥发油：原材料采自海南，经海南医学院生药学杨卫丽教授鉴定，经本课题组提取得到浅黄色挥发油，经GC-MS 检测BITC 含量为99.4%，4 ℃下密封保存。

试剂：单硬脂酸甘油酯（国药集团化学试剂有限公司）；辛癸酸甘油酯（上海麦克林生化科技有限公司，含量≥98.0%）；大豆卵磷脂（上海罗恩化学技术有限公司）；异硫氰酸苄酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，含量＞98.0%）；聚醚F188（上海罗恩化学技术有限公司）；司班80（天津市永大化学试剂有限公司）；吐温80（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；乙腈（色谱纯，默克）；10 kDa 超滤离心管（密理博中国有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，赛默飞世尔中国有限公司）；氟康唑（上海源叶生物科技有限公司，编号：YY10480-1g，含量≥99%）；RPMI 1640（Gibco）、SDA 培养基（广东环凯微生物科技有限公司）。实验所用水均为超纯水。

供试菌株：质控菌株Ca ATCC 10231（广州环凯微生物科技有限公司），临床分离菌株有Ca53、Ca 27、Ct 68、Ct 112、Ct 56，经ITS 基因序列测定确定。

仪器与设备：Zetasizer Nano ZSE 纳米粒度及电位仪（英国马尔文仪器有限公司）；HT-7800透射电子显微镜（日本日立）；安捷伦1260 液相色谱仪（美国安捷伦仪器有限公司）；JY92-IIDN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RODI-160B1 超纯水仪（厦门锐思捷水纯化技术有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）；Centrifuge5430 台式离心机（德国艾本德）；Synergy HTX多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 BITC-NLC 的制备 采用熔融乳化超声法制备BITC-NLC。分别称取50.0 mg 辛癸酸甘油酯，50.0 mg 单硬脂酸甘油酯和100.0 mg BITC，70 ℃加热溶解作为油相，分别称取400.0 mg 大豆卵磷脂和400.0 mg 聚醚F188，用20 mL 水于70 ℃溶解作为水相，在恒温磁力搅拌（800 r/min）下将水相缓慢滴入油相中，并持续搅拌20 min 形成初乳。将初乳用探头超声（超声振幅80%，开5 s，停5 s）15 min 后，冰水浴冷却固化2 min，过0.22 μm 微孔滤膜即得BITC-NLC。

1.2.2 BITC 含量测定 建立高效液相色谱法（high performanceliquid chromatography， HPLC）测定BITC-NLC 中的BITC 含量。

（1）溶液配制。精密量取BITC-NLC 50 μL于10 mL 容量瓶中加7 mL 乙腈，涡旋30 s 破乳，再加水定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得样品溶液。精密称取BITC 约10 mg 置于100 mL 量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成BITC 浓度为100 μg/mL 的对照品储备液。

（ 2 ）HPLC 条件。色谱柱Aglient C18 柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），柱温30 ℃；流动相乙腈∶水（70∶30， V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长245 nm；进样量10 μL。

（3）系统适用性试验。取制备的空白制剂NLC 和BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法制备样品溶液和标准溶液，按1.2.2-（2）方法进样检测并记录色谱图。

（4）线性关系考察。分别精密量取1.2.2-（1）中制备的对照品储备溶液3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 mL 于5 mL 量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀作为系列标准溶液。按1.2.2-（2）方法进样检测，以BITC 峰面积（A）为纵坐标，浓度（C，μg/mL）为横坐标，进行线性回归分析。

（5）计算最低定量限和检测限。取线性溶液最低点对照品溶液稀释，按1.2.2-（2）方法进样检测，分别按照信噪比S/N=10 及S/N=3，计算BITC 的最低定量限和检测限。

（ 6 ） 重复性和稳定性试验。取制备的BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法处理6 份样品溶液，分别按1.2.2-（2）方法进样检测，计算BITC含量的相对标准偏差（ RSD ）。取制备的BITC-NLC，按1.2.2-（1）方法处理样品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 进样检测，计算BITC含量的RSD 值。

（7）加样回收率试验。制备含量相当于处方含量的80%、100%、120%的BITC 对照品溶液，将其加入已知BITC 含量的NLC 样品溶液中，每个浓度3 份，进样检测，计算得加样回收率及RSD 值。

1.2.3 NLC 制备工艺的优化 采用熔融超声乳化法制备NLC，预设定处方后先摸索制备温度、初乳形成的滴加速度等条件，并采用单因素试验考察确定影响制备工艺的因素，最终采用正交试验法优化NLC 最佳制备工艺。

1.2.4 BITC-NLC 处方筛选 首先选择BITCNLC处方中脂质及表面活性剂，并采用单因素试验考察确定影响制备处方的因素，最终采用正交试验优化BITC-NLC 的最佳处方组成。

1.2.5 BITC-NLC 的形态观察 将制备的BITCNLC用超纯水稀释后滴至铺有碳膜的铜网上，静置20 min，用滤纸吸干混悬液，用2%磷钨酸溶液（pH 6.5）负染1 min，风干后置于透射电子显微镜下观察BITC-NLC 的形态并拍照。

1.2.6 BITC-NLC 的粒徑分布及Zeta 电位测定将制备的BITC-NLC 用超纯水稀释后，采用纳米粒度及电位分析仪检测其粒径分布及Zeta 电位，平行测定3 次，取平均值。

1.2.7 BITC-NLC 包封率和载药量测定 精密量取50 μL 制备的BITC-NLC 于10 mL 容量瓶中，加7 mL 乙腈，涡旋30 s 破乳，再加水定容至10 mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，按1.2.2-（2）方法进样检测，并计算药物浓度及相应体积的质量，平行测定3 次；精密吸取1 mL 制备的BITCNLC于超滤离心管中，8000 r/min 离心20 min 后，在外管中精密量取50 μL 游离药物溶液于10 mL容量瓶，加7 mL 乙腈再加水定容，按1.2.2-（2）方法进样检测，并计算游离药物浓度及相应体积的质量，平行测定3 次，按以下公式计算包封率（encapsulation efficiency， EE）和载药量（drugloading， DL）：EE=系统中包封的药量/总药量×100%DL=系统中包封的药量/总重量×100%1.2.8 BITC-NLC 稳定性考察 将BITC-NLC 置于室温（25 ℃）下贮存30 d，在不同时间（0、5、10、15、20、25、30 d）观察其外观，测定粒径、Zeta 电位及包封率，评价其稳定性。

1.2.9 BITC-NLC 抗假丝酵母菌活性研究 采用微量稀释法（M38-A2）[19]测定BITC-NLC 和BITC对Ca 和Ct 的最低抑菌浓度（minimum inhibitoryconcentration， MIC）和最低杀菌浓度（minimumfungicidal concentration， MFC）。将Ca 和Ct 接种、活化，取无菌96 孔平底微量培养板，配制不同浓度的BITC-NLC 和BITC 溶液并加菌悬液后，培养板置于35 ℃恒温箱中培养48 h，观察结果。每次同时制备1 个质控菌药敏板（以Ca ATCC 10231为质控菌），若质控菌药敏板中氟康唑（fluconazole，FLZ） 的MIC 值位于规定的范围， 即0.25～1.0 μg/mL，则认为此次试验操作有效。判读MIC值方法：与培养48 h 的无药对照孔比较抑制率达到50%的最低药物浓度。设置3 次重复，MIC 值取平均值。MFC 的测定以培养72 h 后，于清晰透明的微量试验孔和无药对照孔中各吸取20 μL 菌悬液，倾注在SDA 平板上，培养48 h 后进行活菌计数，小于3 CFU 的最低药物浓度即MFC。

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0 软件进行正交试验设计，并对结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 制剂含量分析方法的建立

2.1.1 系统适用性试验 由BITC 标准溶液、BITC-NLC 和空白制剂NLC 的HPLC 色谱图（图1）可知，在设定的色谱条件下，BITC 出峰时间为7.2 min，与其他成分的分离良好，空白样品无干扰。

2.1.2 线性试验 以BITC 峰面积（A）为纵坐标，浓度（C， μg/mL） 为横坐标， 得回归方程：A=5.076×C+0.052（r=0.9997）。结果表明，BITC在2.0～64.0 μg/mL 浓度范围内线性关系良好。

2.1.3 最低定量限和检测限 按S/N=10 计，BITC 的最低定量限为0.2 μg/mL；按S/N=3 计，BITC 的最低检测限为0.08 μg/mL。

2.1.4 重复性和稳定性试验 重复性试验结果显示，BITC 含量的RSD 值为1.29%，表明该方法重复性良好；稳定性试验结果显示，BITC 含量的RSD 值为1.80%，表明样品在24 h 内稳定。

2.1.5 加样回收率试验 相当于处方含量80%、100%、120%的高、中、低3 种浓度的平均加样回收率分别为98.83%、100.34%、100.47%，RSD值分别为1.15%、1.63%、1.73%。

2.2 NLC 制备工艺的影响因素考察采用熔融超声乳化法制备NLC，预设定处方为辛癸酸甘油酯100 mg ， 单硬脂酸甘油酯100 mg，大豆卵磷脂200 mg，聚醚F188 400 mg，20 mL 水进行制备工艺考察。

2.2.1 制备温度的选择 制备温度应在脂质熔点以上，以保证药物和脂质在制备过程中保持熔融状态，但温度过高药物易损失，经试验观察，确定温度为70 ℃。

2.2.2 初乳形成的滴加速度 在初乳形成过程中，滴加速度过快，脂质相和水相不能充分混合，难以得到均匀的分散液，经反复试验，最终确定20 mL 水相滴加时间为5 min。

2.2.3 制备工艺的正交试验 采用预设处方，制备温度在70 ℃，初乳滴加时间5 min，选择超声时间、超声振幅、搅拌速率、搅拌时间4 个因素进行单因素考察制备工艺，结果显示，搅拌速率对NLC 的粒径及稳定性影响最小，因搅拌速度快时锥形瓶易倾倒，综合考虑粒径大小及操作等因素，搅拌速度定为800 r/min，选择影响制备工艺的其他因素进行L933 的正交试验，其中A 搅拌时间（10、20、30 min）、B 超声振幅（60%、80%、100%）、C 超声时间（5、10、15 min），以平均粒径为实验指标进行统计分析，正交试验分析结果见表1。由表1 的方差结果可以看出，因素C（超声时间）对制剂的粒径影响最显著，其次是因素B（超声振幅）、因素A（搅拌时间），最优组合为A3B2C3，因搅拌时间对制剂的粒径影响无显著差异，且搅拌20 min 和30 min 时平均粒径基本相同，考虑到节省制备时间，最终选择搅拌时间为20 min。因此最佳制备工艺为：初乳搅拌速率800 r/min，搅拌时间20 min，超声破碎振幅80%，超声时间15 min。按照最佳制备工艺平行制备3 批NLC，检测其平均粒径及分布，平均粒径为（75.48±0.68）nm，PDI 为0.248±0.012。

2.3 BITC-NLC 处方筛选

2.3.1 脂质的选择 固态脂质是纳米制剂的重要组成，不仅能使纳米粒保持稳定，还可为其提供形态支撑，使其具有更好的缓释效果，而合适的液态脂质不仅能够提高制剂的载药量和包封率，还能使其更加稳定。通过查阅文献[17-18]，最终选择单硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯的固液混合脂质。

2.3.2 表面活性剂的选择 一般用亲水亲油平衡值（hydrophilelipophile balance， HLB）衡量表面活性剂分子的亲水和亲油程度。通常，HLB 值在3～6 范围内适于W/O 型乳液，在8～18 范围内适于O/W 型乳液，研究发现将高HLB 值的表面活性剂和低HLB 值的表面活性剂复合使用制备得到的NLC 效果最好。因此，本研究选用复合乳化剂（按m/m 1∶1 混合）大豆卵磷脂（HLB=10）与吐温80（HLB=15）、大豆卵磷脂（HLB=10）与聚醚F188（HLB=16）、司班80（HLB=4.3）与吐温80（HLB=15）、司班80（HLB=4.3）与聚醚F188（HLB=16）相比较，结果发现选用大豆卵磷脂（HLB=10）与聚醚F188（HLB=16）作为混合乳化剂所制得的制剂为澄清透明溶液，其他为半透明或乳白色混悬液，因此选择大豆卵磷脂与聚醚F188 作为混合乳化剂。

2.3.3 处方组成的正交试验 按照2.2.3 优化得到的最佳制备工艺，选择脂质总量、固液脂质（单硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯）比例、复合乳化剂总量、复合乳化剂（大豆卵磷脂与聚醚F188）的比例、挥发油用量共5 个因素进行单因素试验，结果显示，固液脂质比例对制剂的平均粒径、Zeta电位、包封率等影响均较小，因此以固液比例1∶1（m/m），选择其他4 个影响处方工艺的因素进行L934 的正交试验，以平均粒径、Zeta 电位、包封率为实验指标进行统计分析，表2 为正交因素水平，表3 为正交试验及试验结果，表4 为正交试验分析结果。

由表4 的方差结果可以看出，4 个因素对3个实验指标中平均粒径的影响均为极显著，影响程度顺序为A>C>D>B，因素C、D、A 对Zeta电位的影响均为极显著，因素B 对Zeta 电位则无显著差异，其影响程度顺序为C>D>A>B，因素A、B、D 对包封率的影响均为极显著，因素C 对其影响显著，影响程度顺序为A>B>D>C。因素A（脂质总量）对平均粒径和包封率的影响均最大，且均为极显著差异，对平均粒径的影响虽为极显著但相比其他2 个实验指标影响较小，脂质总量越小，平均粒径越小，但包封率越小，而脂质总量增大对Zeta 电位的影响是先增大后减小，综合考虑粒径和包封率，脂质总量选择A2；其次因素B（复合乳化剂总量）对平均粒径和包封率影响均较大，且复合乳化剂总量越大，粒径越小，包封率越大，因此选择B3；因素C（大豆卵磷脂与聚醚F188 的比例）对平均粒径和Zeta 电位影响大且为极显著差异，对包封率影响显著，综合考虑选择C1；因素D（挥发油用量）对3 个实驗指标影响均较大，因此综合考虑选择D2。最终的处方为：固液混合脂质单硬脂酸甘油酯50.0 mg 和辛癸酸甘油酯50.0 mg，大豆卵磷脂400.0 mg，聚醚F188 400.0 mg，挥发油100.0 mg，水20.0 mL。

2.4 BITC-NLC 的形态表征

在透射电子显微镜下观察BITC-NLC 的形态（图2），由图2 可知纳米粒呈类球形，分布均匀，无明显颗粒聚集现象。

2.5 BITC-NLC 的粒径分布及Zeta 电位

按照最佳处方和工艺平行制备3 批BITC-NLC，检测其粒径分布（图3）及Zeta 电位（图4），BITC-NLC 粒度呈正态分布，纳米粒径为（79.13±1.41）nm，PDI 为0.248±0.011，粒度大小均匀一致，Zeta 电位为（–21.77±1.16）mV，说明该方法制备得到的BITC-NLC 粒度分布均匀，重现性好，体系较稳定。

2.6 BITC-NLC 的包封率和载药量

采用HPLC 测定3 批BITC-NLC 的包封率为91.52%±0.60%，符合药典标准（不低于80%）[20]，载药量为9.15%±0.06%。

2.7 BITC-NLC 稳定性

将BITC-NLC 置于室温（25 ℃）下贮存30 d，在不同时间观察其外观，结果发现BITC-NLC 的外观在30 d 时未发生明显变化，粒径、Zeta 电位及包封率结果见表5。BITC-NLC 的平均粒径稍有增大，包封率虽有下降但在药典要求范围内，说明该方法制备的制剂短期稳定性尚可。

2.8 BITC-NLC 抗假丝酵母菌活性

采用微量稀释法测定BITC-NLC 和BITC 对6 株Ca 和Ct 的MIC 和MFC，结果见表6。其中BITC-NLC 对供试菌株的MIC 范围为8.0～32.0 μg/mL，BITC 对供试菌株的MIC 范围为32.0～64.0 μg/mL，BITC-NLC 对供试菌株的MIC和MFC 均低于BITC，这说明制备的新制剂BITC-NLC 能增强BITC 的抗假丝酵母菌的效果，且其对耐药菌株Ca 27 和Ct 56 也具有抑制作用，效果优于对照药物氟康唑（FLZ）。

3 讨论

近年来，以假丝酵母菌为代表的侵袭性真菌感染呈逐年上升趋势，尤其是对某些严重的免疫缺陷患者如艾滋病、中性白细胞减少等，以及恶性肿瘤患者、器官移植受者等，其发病率和死亡率高，给临床治疗带来很大困难。白假丝酵母菌（Ca）是引起假丝酵母菌感染的主要种群，但在热带及亚热带地区，热带假丝酵母菌（Ct）已成为仅次于Ca 的第二大假丝酵母菌。目前，由于以氟康唑为代表的唑类抗真菌药物在临床上的广泛使用，使真菌耐药性大大增加，例如WU 等[11]研究了海南的211 例头颈癌患者中假丝酵母菌的感染情况，其中Ct 的感染率仅次于Ca，为22.6%，其中氟康唑耐药率高达14.3%。这种临床真菌的耐药性常常导致治疗失败，尤其是对免疫功能低下的患者容易导致深部真菌感染而成为患者死亡的主要原因之一[9-10]，因此，针对抗真菌药物的耐药性问题，目前的研究一方面要探讨抗真菌药物产生耐药性的机制，采用2 种或多种药物联合应用来解决真菌耐药性的问题，另一方面是加快新型抗真菌药物的研制和开发[12-14]。本课题组前期研究发现，番木瓜籽挥发油的主成分为异硫氰酸苄酯（BITC），含量高达99%，具有天然、无污染、纯度高等特点，且对多种假丝酵母菌均具有明显的抑制作用[7-8]。但由于BITC 水溶性差、易挥发、易降解等缺点，限制了其应用。

针对BITC 的上述缺点，在以往研究中大多采用饱和水溶液法以环糊精为壁材对BITC 进行包合，如LI 等[21]采用β-环糊精对BITC 进行包合，以增加其溶解度，提高热稳定性，减缓释放速率，从而达到延长其防腐抑菌的效果和目的，该课题组[22]采用相同方法以β-环糊精的衍生物羟丙基-β-环糊精为壁材对BITC 进行包埋也达到了延长抑菌效果的作用。王家平[23]也采用羟丙基-β-环糊精将BITC 进行包合得到包封率达到78%的包合物后，再以羟丙甲纤维素为主的凝胶骨架材料将包合物进行压片制成胃悬浮片，该研究的主要目的是掩盖BITC 的刺激性气味，延长其半衰期，减少给药次数，提高癌症患者的顺应性。LIU 等[24]采用饱和水溶液法将3 种异硫氰酸酯（包括BITC）与γ-环糊精形成的包合物，其中BITC 与γ-环糊精形成的包合物延长了BITC 对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，经包合物处理的金黄色葡萄球菌的毒力基因的表达显著下调，并通过模型预测了该包合物在熟鸡胸肉中抑制金黄色葡萄球菌的情况。该课题组[25]使用α-环糊精并加入壳聚糖对BITC 进行包合，延长了抗菌能力，增强了抗氧化活性，该包合物可作为食品包装材料特别是在牛肉保鲜方面具有开发应用的潜力。

以上采用环糊精对BITC 包合的研究大多关注于BITC 在食品抑菌包装材料方面的开发应用，其存在制备时间长（搅拌时间为3～7 h），且使用有机溶剂乙醇，包封率低等问题。UPPAL 等[26]改进以上方法，采用超声波均质机超声900 s 制备β-环糊精及羟丙基-β-环糊精的BITC 包合物，大大缩短了制备时间，但仍需使用有机溶剂。田甜等[27]以大豆分离蛋白-磷脂酰胆碱作为表面活性剂，以BITC 与大豆油混合物作为油相，采用射流空化技术制备纳米乳液，目的为扩大BITC在食品行业抗菌中的应用。该方法得到的纳米乳的平均粒径为252 nm，Zeta 电位为-27.2 mV，通过射流空化提高了乳液体系的冻融稳定性，但该方法对设备要求较高。

本研究采用融熔乳化超声法[15]制备得到纳米制剂BITC-NLC，该方法具有操作步骤简单、制备时间短、不使用有机溶剂、对试验设备要求不高、实验重复性良好等优点。研究先确定了制备温度及初乳形成的滴加速度，选择超声时间、超声振幅、搅拌速率、搅拌时间4 个因素进行單因素影响试验优化制备工艺，最终选择3 个主要因素进行正交试验设计得到最佳制备工艺：制备温度70 ℃，初乳搅拌速率800 r/min，搅拌时间20 min，超声破碎振幅80%，超声时间15 min。

采用同样方法优化BITC-NLC 的处方组成，首先对脂质及表面活性剂进行筛选，选择脂质总量、固液脂质（单硬脂酸甘油酯和辛癸酸甘油酯）比例、复合乳化剂总量、复合乳化剂（大豆卵磷脂与聚醚F188）的比例、挥发油用量5 个因素进行单因素影响试验后，选择4 个主要因素进行正交试验，最终处方组成为：辛癸酸甘油酯50.0 mg，单硬脂酸甘油酯50.0 mg，异硫氰酸苄酯100.0 mg，大豆卵磷脂400.0 mg，聚醚F188 400.0 mg，蒸馏水20.0 mL。对该制剂从外观、形态、粒径、Zeta电位、包封率、载药量等方面进行表征和评价，该制剂形态呈类球形，分布均匀，粒径小，平均粒径为79.13 nm，Zeta 电位为–21.77 mV，体系稳定，包封率高，为91.52%，30 d 短期稳定性良好。

本研究在制备得到新的制剂BITC-NLC 后，采用微量稀释法研究了BITC-NLC 和BITC 对假丝酵母菌中具代表性的Ca 和Ct 的抑制作用，结果表明BITC-NLC 的抗假丝酵母菌的活性强于BITC，这可能是因为新制剂BITC-NLC 将BITC保护起来增强了稳定性，且具有缓控释作用，因此增强了BITC 的抑菌效果。更重要的是BITC-NLC 对Ca 和Ct 的耐药菌株也具有抑制作用，且效果优于对照药物氟康唑（FLZ）。这为日益严峻的假丝酵母菌对常用抗真菌药物的耐药问题提供了新的解决方案，也为番木瓜籽的合理开发和综合应用提供了依据。

4 结论

本研究在单因素影响试验的基础上，通过正交试验优化法采用熔融乳化超声分散法制备得到番木瓜籽挥发油纳米结构脂质载体，具体制备流程和处方如下：辛癸酸甘油酯50.0 mg，单硬脂酸甘油酯50.0 mg，异硫氰酸苄酯100.0 mg，在70 ℃加热溶解作为油相，大豆卵磷脂400.0 mg 和聚醚F188 400.0 mg 加水至20.0 mL 于同温度下溶解作为水相，在800 r/min 搅拌下将水相缓慢滴入油相中，并持续搅拌20 min 形成初乳，用探头超声（超声振幅80%）15 min 后冰水浴固化过滤即得。该制剂经表征和评价后，粒径小，稳定性好，包封率高，对假丝酵母菌尤其是耐药菌株的抑制作用强。本研究不仅得到了天然抗真菌的新剂型，更为产量高且多被丢弃的番木瓜籽的合理开发和利用提供了依据。

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