XIRP2和HCN4在心肌脂肪浸润致猝死者心脏传导系统表达研究

张 静,陈 巍,丁 艳,刘展展,曹 畅,方世勇,朱旭阳,陈 光,徐 祥

(1.皖南医学院 法医学院,安徽 芜湖 241002;2.芜湖市公安局 刑警支队,安徽 芜湖 241000;3.阜阳市公安局 刑事科学技术研究所,安徽 阜阳 236000)

心肌脂肪浸润(myocardial adipose infiltration)既往称为脂肪心(adipositas cordis),以心肌间质出现脂肪浸润为特点,病变常见于右心室,严重者可引起心源性猝死,且死者生前无明显症状或体征,诊断主要依靠尸体解剖和组织病理学检查[1-2]。既往研究发现心肌脂肪浸润可累及心脏传导系统,出现窦性心动过缓及房室传导阻滞[3],提示猝死机制可能与心律失常相关。目前心肌脂肪浸润致猝死案例中心脏传导系统相关分子标记物的研究尚未见系统报道。含心肌动蛋白重复序列蛋白2(xin actin binding repeat containing protein 2,XIRP2)为含心肌动蛋白重复序列蛋白(xin actin binding repeat containing protein,XIRP)家族成员,XIRP2能够调控XIRP1[4],影响离子通道定位过程,进而影响心肌电生理功能[5]。超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channel 4,HCN4)属于超级化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因家族,包含HCN1～HCN4四个亚型,其中HCN4主要表达于心脏传导系统窦房结组织中,对窦房结正常起搏功能和窦性停搏时浦肯野细胞自动节律的产生有重要意义[6]。本研究主要观察心肌脂肪浸润猝死者心脏传导系统XIRP2和HCN4蛋白表达情况,探讨XIRP2和HCN4作为分子标志物的可行性,以期为该类案件的法医学鉴定提供参考。

1 资料与方法

1.1 分组 收集某司法鉴定中心2015～2022年明确诊断心肌脂肪浸润致猝死者8例为猝死组,选取10例外伤致死者为对照组。每例均经大体解剖、组织病理学检验及常规毒(药)物检验。针对尸体标本可能进行的科学研究实验已在尸检告知书中通知死者家属并获得同意。本研究符合医学伦理要求。

1.2 试剂 兔抗人HCN4抗体(APC-052,Alomone公司,以色列),兔抗人XIRP2抗体(11896-1-AP,Proteintech,美国);DAB显色液(北京天根生化科技有限公司);HE和Masson三色染色试剂盒(北京雷根生物有限公司)。

1.3 方法 收集死者性别、年龄、既往史、大体解剖所见及组织病理学检验信息,其中组织病理学检验包括心脏传导组织HE染色和Masson三色染色,免疫组织化学染色(IHC)观察HCN4和XIRP2蛋白表达情况。

1.3.1 HE染色 心脏取材,固定后脱水、透明、浸蜡、包埋,制备5 μm厚的石蜡切片,70℃烘烤1 h脱蜡。二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min,梯度酒精脱蜡至水。苏木精10 min,水洗5 min,1%盐酸乙醇分化5 s,自来水蓝化5 min,伊红染色30 s,脱水,透明,中性树胶封固。

1.3.2 Masson三色染色 切片脱蜡步骤同上。Weigert铁苏木素10 min,酸性乙醇分化液5 s,Masson蓝化液30 s,蒸馏水洗1 min,丽春红品红7 min,弱酸工作液1 min,磷钼酸分化,弱酸工作液、苯胺蓝、弱酸工作液各1 min,无水乙醇快速脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

1.3.3 IHC 切片脱蜡步骤同上。3%H2O2室温避光封闭30 min,0.01 mol/L枸橼酸钠抗原修复液高温加热15 min,5%BSA封闭液室温封闭1 h。一抗4℃过夜孵育,次日,37℃复温30 min,PBS溶液漂洗,二抗室温孵育1 h,PBS溶液漂洗,SABC室温孵育1 h,DAB显色,苏木素复染2 min。

1.3.4 图像分析 利用Olympus光学显微镜观察免疫组化切片,在统一的背景条件下,从每张切片随机选取5个视野(200×)进行图像采集,使用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0计算各组累积光密度值(integrated optical density,IOD),取均值。

2 结果

2.1 两组基本情况比较 猝死组8例,男性5例,女性3例,年龄16～82岁,中位年龄48.5岁(26.5,60.5);对照组10例,男性5例,女性5例,年龄24～80岁,中位年龄45岁(31,56)。两组年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 8例心肌脂肪浸润致猝死者基本情况

2.2 组织病理学改变 猝死者大体解剖见心外膜脂肪含量多、覆盖范围广,主要侵及右室壁及心脏传导系统(图1)。HE及Masson三色染色见右室壁、窦房结、房室结大量脂肪组织浸润,残留心肌呈条索状或孤岛状,心肌细胞萎缩与肥大并存,脂肪细胞间灶性淋巴细胞浸润,心内膜下心肌及左右束支浦肯野细胞收缩带坏死(图2),右室壁脂肪浸润处,未见胶原纤维组织(图3)。

A.心外膜大量脂肪覆盖;B.右室壁脂肪浸润;C.窦房结脂肪浸润;D.房室结脂肪浸润。图1 猝死组心脏大体解剖

A.窦房结区脂肪浸润,结细胞明显减少(100×);B.房室结区脂肪浸润,结细胞明显减少(100×);C.浦肯野细胞收缩带坏死(200×);D.右室壁脂肪浸润,脂肪间及残存心肌旁淋巴细胞浸润(40×)。图2 猝死组传导系统及右室心肌HE染色

A.窦房结区脂肪浸润(100×);B.房室结区脂肪浸润(100×);C.右室壁脂肪浸润(200×)。图3 猝死组传导系统及右室心肌Masson三色染色

2.3 IHC HCN4与XIRP2蛋白呈棕黄色颗粒,主要表达于传导系统P细胞及浦肯野细胞的细胞膜和胞浆中(图4～6);与对照组相比,猝死组HCN4与XIRP2在窦房结房室结内表达增多,左右束支内表达减少。

A.XIRP2在猝死组窦房结呈强阳性;B.XIRP2在对照组窦房结呈阳性;C.HCN4在猝死组窦房结呈强阳性;D.HCN4在对照组窦房结呈阳性。图4 XIRP2与HCN4蛋白在两组窦房结表达比较(IHC 200×)

A.XIRP2在猝死组房室结呈强阳性;B.XIRP2在对照组房室结呈阳性;C.HCN4在猝死组房室结呈强阳性;D.HCN4在对照组房室结呈阳性。图5 XIRP2与HCN4蛋白在两组房室结表达比较(IHC 200×)

A.XIRP2在猝死组左右束支呈阳性;B.XIRP2在对照组左右束支呈强阳性;C.HCN4在猝死组左右束支呈弱阳性;D.HCN4在对照组左右束支呈阳性。图6 XIRP2与HCN4蛋白在两组左右束支表达比较(IHC 200×)

与对照组比较,猝死组窦房结、房室结HCN4、XIRP2蛋白表达水平增高(P<0.05),左右束支HCN4、XIRP2蛋白表达水平降低(P<0.05)。猝死组窦房结及房室结HCN4、XIRP2蛋白表达水平高于左右束支(P<0.05),对照组窦房结及房室结HCN4、XIRP2蛋白表达水平低于左右束支(P<0.05)。猝死组窦房结HCN4蛋白表达水平高于房室结(P<0.05),窦房结XIRP2蛋白表达水平低于房室结(P<0.05)。对照组中XIRP2、HCN4蛋白在窦房结和房室结间表达差异无统计学意义。见表2。

表2 HCN4、XIRP2在两组传导系统不同部位表达分析

3 讨论

本研究中,心肌脂肪浸润致猝死者心脏肥大,质量增加,心肌脂肪浸润以右室及传导系统为主,符合心肌脂肪浸润的诊断,HCN4与XIRP2蛋白主要表达于P细胞和浦肯野细胞胞膜与胞浆,与对照组相比,猝死组两种蛋白在窦房结和房室结内表达升高,与心源性猝死及电击致死研究结论一致[7-8],而上述蛋白在左右束支表达降低。此外,这两种蛋白在同组内传导系统不同部位的表达水平存在差异:对照组上述蛋白在左右束支的表达水平高于窦房结和房室结,猝死组与之相反;猝死组窦房结HCN4蛋白表达高于房室结,窦房结XIRP2蛋白表达水平低于房室结。

既往研究表明,心外膜下脂肪组织能够调节肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮系统[9-10],通过刺激细胞增强因子2A激活XIRP2基因表达[10],且XIRP2在窦房结与HCN4共表达[4,11]。HCN4为If通道的结构蛋白[6],心外膜下脂肪细胞通过分泌去甲肾上腺素激活β-肾上腺素能受体可增强If[12-13],过表达HCN4小鼠心脏对心输出量增高的适应性降低,离子通道功能改变,可增加室速和心力衰竭的风险[14-15],而心力衰竭可引起XIRP2表达增加[11],HCN4过表达小鼠无心肌纤维化,与本研究中窦房结组织病理学表现一致。浸润的脂肪与心肌细胞间无组织分隔[16],影响上述蛋白表达,HCN4与XIRP2蛋白表达可相互促进。值得注意的是,与对照组相比,猝死组窦房结及房室结XIRP2与HCN4蛋白表达升高,左右束支刚好相反,而猝死组内窦房结和房室结中HCN4与XIRP2蛋白表达存在差异,可能与传导系统不同部位间的调控差异有关。

目前,关于心肌脂肪浸润及其导致猝死的原因和机制尚不明确,给法医学死亡原因鉴定带来挑战。上述蛋白在传导系统不同部位的表达趋势差异可能为该类案件提供新思路,进一步探讨心肌脂肪浸润引起心源性猝死的分子病理学机制有助于精准法医学的发展。采用分子影像技术监测其在体状态下的改变,可在心脏结构改变之前发现心脏电生理功能的异常情况,减缓或逆转蛋白表达趋势向病理状态的改变,可为相关心力衰竭提供新的治疗思路[17-18],顺应精准医学的发展趋势。