鼻咽癌组织中miR-1273f的表达情况及其临床意义▲

黄永塔 李艳艳 张力行 刘 霞 张少杰 叶秋容 莫祥兰

(广西壮族自治区人民医院1 病理科,2 耳鼻咽喉头颈科,广西南宁市 530021)

鼻咽癌好发于我国两广地区,其发生与EB病毒感染密切相关。由于病变位置深,鼻咽癌早期缺乏明显的临床症状、体征,易发生淋巴结转移甚至远处转移。鼻咽癌患者对放疗敏感,早发现、早治疗有助于提高患者总体生存率,但肿瘤复发和转移仍是鼻咽癌治疗效果不佳的首要原因,也是导致患者总生存率较低的主要原因[1]。淋巴结转移和远处转移是影响鼻咽癌患者总生存率的独立预后因素[2]。因此,寻找能够准确预测鼻咽癌淋巴结转移或远处转移的分子标志物,进而对鼻咽癌进行预后分层,并筛选出高危患者进行早期干预,是鼻咽癌治疗领域的研究重点。鼻咽癌的发生和发展涉及的因素复杂,其中基因表达异常与其密切相关[3]。miRNA是内源性非编码RNA,属于表观基因组的一部分,在转录后的基因水平发挥调控作用,与多种疾病的病理过程及发展进程相关。miR-1273f是近几年发现的miRNA,在多种疾病中表达失调,与肿瘤细胞增殖、迁移及耐药等均有关系[4]。目前已有较多文献报告miRNA与鼻咽癌侵袭、转移的关系,然而多数研究数据只基于体外细胞实验,基于鼻咽癌组织的相关研究较少。鼻咽癌的组织类型有角化型鳞状细胞癌、非角化型鳞状细胞癌、基底样鳞状细胞癌等,非角化型鳞状细胞癌又可分为分化型和未分化型,超过95%的鼻咽癌为未分化非角化型[5]。故本研究主要检测miR-1273f在未分化非角化型鼻咽癌组织中的表达水平,并分析miR-1273f表达水平与鼻咽癌患者临床病理参数的关系,以及对鼻咽癌临床诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年1月至2018年10月期间在我院住院的60例鼻咽癌患者的临床资料,并将其设为鼻咽癌组,其中男性41例、女性19例,年龄25～81岁,中位年龄46岁。纳入标准:(1)临床和病理资料完整;(2)术前行鼻咽部及颈部MRI、胸部X线/CT、腹部B超及骨扫描等相关检查,明确有无鼻咽癌转移病灶及转移范围;(3)活检标本均为放化疗前取材;(4)经活检组织病理、免疫组化染色和EB病毒编码的RNA原位杂交检测,明确诊断为未分化非角化型鼻咽癌(由两名病理专家诊断)。排除标准:鼻咽癌复发者;与EB病毒感染不相关的鼻咽部角化型鳞状细胞癌或乳头状腺癌等;活检标本取材时挤压或烧灼变性明显,以及活检组织少者。另纳入15例鼻咽黏膜隆起查因患者为对照组,其中男性6例、女性9例,年龄14～68岁,中位年龄42岁。纳入标准:活检组织病理诊断为黏膜慢性炎症;临床病理资料完整。排除标准:活检标本取材时挤压或烧灼变性明显。鼻咽癌组和对照组研究对象的性别和年龄差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。本研究方案经我院医学伦理委员会审核通过(编号:伦理-KY-ZC-2020-008号)。

1.2 临床病理资料收集 通过医院病案系统收集两组患者的一般资料及病理诊断结果,以及鼻咽癌组患者的临床参数(肿瘤部位、初诊时转移情况、T分期、基于2010年国际抗癌联盟分期标准的临床分期[6])。

1.3 miR-1273f表达水平的检测

1.3.1 石蜡组织总RNA的提取:选取密封保存完好的石蜡组织,按照10 μm/卷的厚度进行切卷,每个蜡块切取15卷组织并置于RNase-free EP管。按照miRNeasy FFPE试剂盒(QIAGEN公司,批号:217504)的说明书提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)测定RNA样本的A260/A280,其值介于1.8～2.0且RNA浓度≥100 ng/μL,可判断为RNA样品合格。

1.3.2 反转录反应:使用miScript Ⅱ RT试剂盒(QIAGEN公司,批号:218161)进行反转录反应,按照试剂盒说明书进行操作。反转录反应体系包括RNA 5 μL(500 ng)、Bulge-LoopTMmiRNA RT Primer(5 μmol/L)1 μL、5X Reverse Transcription Buffer 2 μL、RTase Mix 2 μL。反转录反应条件为42 ℃ 60 min,95 ℃ 5 min。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测:使用miScript SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN公司,批号:218073)检测组织中miR-1273f表达水平,以U6基因为内参基因。miR-1273f上游引物序列为5′GGAGAUGGAGGUUGCAGUG3′,U6上游引物序列为5′ATTGGAACGATACAGAGAAGATT3′,通用下游引物序列为5′ GGAACGCTTCACGAATTTG3′。PCR的反应体系包括正反向引物各2 μL、cDNA模板2 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,ddH2O补至20 μL。扩增条件为95 ℃ 15 min,94 ℃ 15 s,55 ℃ 30 s,70 ℃ 34 s,后3个步骤共40个循环。反应结束后,确认PCR扩增曲线和溶解曲线,检测每个样本的Ct值,以2-△△Ct法计算目的基因miR-1273f的相对表达水平。

1.4 统计学分析 应用SPSS 25.0软件进行统计分析。非正态分布的计量资料以[M(P25,P75)]表示,组间比较采用Mann-WhitneyU检验;采用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析miR-1273f表达水平诊断鼻咽癌的价值。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组miR-1273f相对表达水平的比较 对照组、鼻咽癌组的miR-1273f表达水平分别为1.04(0.33,2.95)、5.91(1.80,12.87),鼻咽癌组的miR-1273f表达水平高于对照组(z=-3.404,P=0.001)。

2.2 鼻咽癌患者miR-1273f相对表达水平与临床病理参数的关系 初诊时伴有肿瘤转移的鼻咽癌患者miR-1273f表达水平高于无转移的患者(P<0.05),但不同性别、年龄、肿瘤部位、T分期、临床分期的鼻咽癌患者之间miR-1273f表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 不同临床病理特征的鼻咽癌患者miR-1273f相对表达水平的比较[M(P25,P75)]

2.3 miR-1273f表达水平对鼻咽癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,病灶组织miR-1273f表达水平诊断鼻咽癌的曲线下面积为0.786 (95%CI:0.672,0.899;P=0.001),灵敏度为0.53,特异度为0.93,最佳诊断截断值为5.28。见图1。

图1 miR-1273f表达水平诊断鼻咽癌的ROC曲线图

3 讨 论

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一。鼻咽癌患者的预后存在较大的个体差异,即使是临床分期类似的患者,其生存时间仍有较大差异。探索肿瘤淋巴结转移、远处转移的生物学机制,对存在转移风险的鼻咽癌患者及时采取有效的干预措施,是提高鼻咽癌患者生存率的关键。因此,探索鼻咽癌发生、发展的分子机制,筛选出有助于提高鼻咽癌疗效及改善患者预后的分子靶标是目前研究的重点。miRNA是一种重要的内源性非编码RNA,能通过与mRNA的3′非编码区进行互补结合而使mRNA降解,干扰蛋白质翻译过程,从而抑制目标蛋白的合成,其广泛参与并调节人体内多种生理和病理过程,在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。鼻咽癌的发病机制复杂,多种miRNA参与其中,并发挥重要的调节作用。miRNA介导的基因调控机制非常复杂,涉及多个肿瘤细胞功能,包括细胞周期、细胞生长、细胞迁移、细胞侵袭、细胞黏附、上皮-间质转化、细胞外基质修饰等转移相关环节,极大地影响肿瘤患者的临床预后[7]。

近年来,有大量文献报告了miRNA与鼻咽癌侵袭、转移的关系[8-10]。鼻咽癌患者癌组织中miR-421表达水平升高,与鼻咽癌淋巴结转移、远处转移、临床分期有关,且与放疗效果不佳密切相关[11]。miR-299-3p在鼻咽癌组织和细胞系中的表达失调,可促进细胞增殖、集落形成和迁移[12]。Xu等[13]的研究结果显示,EB病毒编码的miR-BART13在鼻咽癌组织中表达上调,通过激活核因子κB信号通路,促进鼻咽癌细胞增殖、上皮-间充质转化和远处转移。miR-1273f位于1号染色体上,在多种疾病中表达失调,与肿瘤细胞增殖、迁移及耐药等均有关系。例如,miR-1273f在重症肌无力患者血浆外泌体中表达上调[14];miR-1273f在2型糖尿病患者中的表达显著降低[15];miR-1273f在宫颈癌组织中异常表达,可能对肿瘤发生、发展起作用[16];miR-1273f通过调节S-期激酶关联蛋白1和细胞周期蛋白D1的表达,参与调控膀胱癌细胞增殖[17];miR-1273f在缺氧诱导的肝细胞癌外泌体中表达显著升高,通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路,增强癌细胞增殖、转移能力[18];miR-1273f在食管癌患者尿液中表达水平升高,其诊断I期食管癌的敏感性优于抗p53抗体,在诊断早期食管癌中具有较好的应用价值[19]。

虽然大量文献研究表明miR-1273f与肿瘤的发生、发展密切相关,但目前尚未检索到关于miR-1273f在鼻咽癌发病机制中作用的研究报告。我们前期通过miRNA芯片筛选及小样本验证研究发现,miR-1273f在鼻咽癌组织中呈过表达趋势。为了进一步探讨miR-1273f与鼻咽癌的关系,本研究检测鼻咽癌组织中miR-1273f的表达水平及其与鼻咽癌患者临床病理参数的关系。本研究结果显示,miR-1273f在鼻咽癌组织中表达水平上调。因此,我们推测miR-1273f在鼻咽癌中扮演癌基因的角色,其异常表达可能是鼻咽癌发生的早期分子生物学异常事件之一。本研究结果还显示, 初诊时伴有肿瘤转移的鼻咽癌患者病灶组织的miR-1273f表达水平显著高于无转移的患者(P<0.05),提示miR-1273f与鼻咽癌淋巴结转移或远处转移密切相关,miR-1273f不仅对鼻咽癌发生起到关键作用,而且也在增强肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力方面发挥极其重要的作用。ROC曲线分析结果显示,病灶组织miR-1273f表达水平诊断鼻咽癌的曲线下面积为0.786,特异度为0.93,灵敏度为0.53,提示miR-1273f对鼻咽癌具有一定的诊断效能,可用于鼻咽癌早期的辅助诊断、治疗后残余肿瘤的评估和肿瘤复发的监测。

总之,miR-1273f在鼻咽癌组织中表达上调,其与鼻咽癌转移密切相关,或可作为临床诊断鼻咽癌的潜在生物学标志物。随着对miR-1273f生物学功能及作用机制的深入研究,miR-1273f有望成为诊治鼻咽癌的新靶点,或可作为评估治疗后残余肿瘤、监测肿瘤复发及预测肿瘤转移风险的分子标志物。