水溶性石墨烯基伊曲康唑滴眼液的制备及其抗真菌活性

李景果 韩奉奇 赵孟阳 何继军 梁珍 张俊杰

河南省人民医院眼科 河南省立眼科医院,郑州 450003

真菌性角膜炎是一种由致病真菌引起的致盲率较高的感染性眼病[1]。然而,其临床治疗受到眼部固有屏障和药物剂型短缺的限制[2],面临着可用抗真菌药物种类极少的问题。传统的三唑类广谱抗真菌药物伊曲康唑在预防侵袭性真菌感染和复发方面非常有效[3]。临床证实伊曲康唑对多种致病真菌菌属感染的治疗效果显著,主要包括曲霉菌、隐球菌、腐皮镰刀菌、念珠菌、囊胚菌、青霉菌等[4-5]。伊曲康唑主要抑制细胞色素P450氧化酶介导的麦角甾醇合成,从而影响真菌细胞壁的通透性来发挥抗真菌作用[6]。目前市售的伊曲康唑主要是全身应用的剂型,包括胶囊、口服液和注射液,且全身用药容易造成较严重的肝肾毒性[7]。伊曲康唑难溶于水,其在水(pH=7.4)中的溶解度仅为1.0 μg/ml,但其对于临床常见镰刀菌属的最小抑菌质量浓度为17.290 μg/ml[8],目前尚缺乏适用于眼科局部用药的相关伊曲康唑剂型。随着纳米技术的发展,目前已有相关纳米剂型提高药物溶解度的报道,如纳米微乳、纳米颗粒、固体脂质体、有机高分子材料修饰等[2,7-8],但采用新型二维材料负载伊曲康唑的研究较少见。石墨烯材料作为21世纪备受瞩目的新材料之一,其碳原子之间没有重排和错位,结构非常稳定,其C—C键长仅为0.142 nm[9-10]。石墨烯基复合材料具有较大的比表面积,可负载更多药物。目前,石墨烯及其衍生物在抗菌领域的研究比较全面,研究者分别从石墨烯的尺寸、表面形态及表面官能团的数量和类型等方面入手,系统地研究了石墨烯、氧化石墨烯、表面改性氧化石墨烯及石墨烯基复合材料的抗菌性能[11-12]。本团队在之前的研究中制备了聚乙二醇修饰的石墨烯材料,负载银纳米颗粒和磺胺嘧啶,成功制备了新型复合抗菌体系[13]。本研究拟制备聚乙二醇修饰的石墨烯材料,负载伊曲康唑得到新型抗菌体系,并对其抗腐皮镰刀菌活性进行评估。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

伊曲康唑(上海化成工业发展有限公司);石墨粉(青岛恒力得石墨有限公司);浓硫酸(开封市芳晶化学试剂有限公司);硝酸钠(天津风船化学试剂科技公司);高锰酸钾(烟台市双双化工有限公司);氯乙酸钠、聚乙二醇(上海麦克林生化科技有限公司);二环己基碳二亚胺、二甲氨基吡啶[阿拉丁试剂(上海)有限公司];透析袋(上海绿鸟生物科技公司)。Nano ZS-90型纳米粒度仪(英国马尔文公司);高速离心机、5810R低温高速离心机(德国Eppendorf公司);荧光正置显微镜(Nikon-80i,日本尼康仪器有限公司);紫外-可见分光光度计(UV-1800SPC,上海美析仪器有限公司);场发射扫描电子显微镜(JSM-7001F,日本电子株式会社);高分辨拉曼光谱仪[HR Evolution,堀场(中国)贸易有限公司];EnVision酶标仪(美国PerkinElmer公司)。

1.2 方法

1.2.1聚乙二醇修饰石墨烯材料的制备 聚乙二醇修饰石墨烯(graphene oxide-modified polyethylene glycol,GO-PEG)材料的制备按照本团队之前报道的方法[13],主要过程如下:首先通过改进的Hummers方法制备氧化石墨烯,随后对氧化石墨烯进行羧基化处理,使氧化石墨烯表面的羟基转变为羧基,最后通过酯化反应将端羟基聚乙二醇键接到表面,得到GO-PEG,实现在保证载药位点的同时改善石墨烯基载体材料的水溶性。

1.2.2扫描电子显微镜观察GO-PEG的形态 将制备好的GO-PEG样品粘贴在导电胶上,喷金,使用扫描电子显微镜对材料进行微观结构和形态观察。

1.2.3Zeta电位分析氧化石墨烯和GO-PEG的电位变化 将5.0 mg待测样品溶解于5 ml去离子水中待用,随后配制不同pH值的缓冲液待用,取0.5 ml氧化石墨烯和GO-PEG样品溶液与0.5 ml的缓冲液混合均匀后放入测试容器中,采用Nano ZS-90型纳米粒度仪进行检测。

1.2.4高分辨拉曼光谱检测GO-PEG中碳材料的有序度 将GO-PEG样品置于载玻片上,将样品压平成膜,厚度约1.0 cm,在高分辨拉曼光谱仪514.5 nm波长激光器、Ar+激发光的条件下进行检测,检测范围为800～2 000 cm-1。在1 350 cm-1处为D峰,由布里渊区边界的具有A1g对称性的κ-点声子呼吸模式引起,具体表示碳材料中的无序结构或缺陷;在1 595 cm-1处为G峰,由碳原子在sp2原子轨道的E2g声子切向拉伸所引起[14]。ID/IG数值越大表明其存在的缺陷越多。

1.2.5溶剂挥发法制备伊曲康唑滴眼液 采用溶剂挥发的方法实现对伊曲康唑的负载:配制10 mg/ml的伊曲康唑四氢呋喃溶液,取5 ml超声分散到计算量5 ml的GO-PEG的水溶液中,旋转蒸发仪中减压除去四氢呋喃溶剂,去离子水定容至5 ml,得到伊曲康唑滴眼液。

1.2.6紫外-可见分光光度计测量伊曲康唑滴眼液药物含量 采用二甲基亚砜溶解伊曲康唑,分别配制0、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00 μg/ml的伊曲康唑标准溶液,采用紫外-可见分光光度计于262 nm处检测各浓度标准溶液紫外吸光度(absorbance,A)值,建立伊曲康唑标准曲线。同时检测伊曲康唑滴眼液(去离子水稀释1 000倍)的A值,通过伊曲康唑标准曲线,计算GO-PEG负载伊曲康唑的含量。

1.2.7微量稀释法和光学显微镜检测伊曲康唑滴眼液对腐皮镰刀菌的抑制作用 采用临床实验室标准化协会(CLSI)微量肉汤稀释法(M38-A2),对临床分离的腐皮镰刀菌进行体外抑菌活性评价。将腐皮镰刀菌接种至96孔板,分别加入药物浓度为0.12、0.47、0.94、1.88、3.75、7.50、15.00 μg/ml的伊曲康唑滴眼液以及GO-PEG空白载体材料,共培养48 h,采用酶标仪测定490 nm处A值并计算腐皮镰刀菌的存活率和伊曲康唑滴眼液的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);同时通过正置光学显微镜观察0.12、0.47、1.88 μg/ml伊曲康唑滴眼液作用下腐皮镰刀菌的生长情况。

2 结果

2.1 氧化石墨烯与GO-PEG的结构与性能表征

氧化石墨烯表现出了典型的二维纳米薄片状结构(图1A)。GO-PEG拥有更多的表面褶皱、突起,但仍保持二维结构(图1B)。此外,GO-PEG增加了氧化石墨烯的亲水性和稳定性,更有利于药物的负载。

图1 氧化石墨烯与GO-PEG的扫描电子显微镜图(×3 000,标尺=1 μm) A:氧化石墨烯呈二维纳米薄片状结构 B:GO-PEG较氧化石墨烯拥有更多的表面褶皱和突起Figure 1 Scanning electron microscope images of GO and GO-PEG (×3 000,bar=1 μm) A:GO had a two-dimensional nanosheet structure B:GO-PEG had more wrinkles and protrusions on the surface than GO

当pH为7.4时,氧化石墨烯和GO-PEG的表面电位分别为-48.63 mV和-42.40 mV,材料的表面电位变化不大,且表面均带负电(图2)。GO-PEG具有较强的负电性,小于-30 mV的负电位,能够增加材料之间的电性斥力,更有利于材料保持稳定性。拉曼图谱显示,GO-PEG的ID/IG值较大(图3),表明材料具有较多的缺陷,有利于实现对药物的负载[15]。

图2 氧化石墨烯和GO-PEG在pH为7.4时的电位分析图(n=3) 材料表面均带强负电荷 GO-PEG:聚乙二醇修饰石墨烯Figure 2 Zeta potential of graphene oxide and GO-PEG at pH 7.4 (n=3) There was a strong negative charge on the surface of the material GO-PEG:graphene oxide-modified polyethylene glycol

图3 GO-PEG的拉曼光谱图 ID/IG值较大 GO-PEG:聚乙二醇修饰石墨烯Figure 3 Raman spectra of GO-PEG The ID/IG value was relatively large GO-PEG:graphene oxide-modified polyethylene glycol

2.2 伊曲康唑滴眼液的药物浓度

伊曲康唑标准曲线的直线方程拟合R2为0.999 9,满足标准曲线要求(图4)。利用此标准曲线,测得伊曲康唑滴眼液中伊曲康唑质量浓度为10 mg/ml。

图4 伊曲康唑质量浓度标准曲线 GO-PEG:聚乙二醇修饰石墨烯Figure 4 Standard curve of itraconazole concentration GO-PEG:graphene oxide-modified polyethylene glycol

2.3 伊曲康唑滴眼液的抑菌性能

伊曲康唑滴眼液对腐皮镰刀菌的MIC值约为1.88 μg/ml(图5)。光学显微镜观察显示,在0.12 μg/ml和0.47 μg/ml质量浓度作用下,腐皮镰刀菌正常生长,呈现出簇状菌丝的形态;在1.88 μg/ml质量浓度作用下,无明显菌丝形成(图6)。

图5 不同倍比稀释质量浓度伊曲康唑滴眼液处理下腐皮镰刀菌存活率变化(n=3) 伊曲康唑滴眼液MIC值约为1.88 μg/mlFigure 5 Changes in survival rate of Fusarium solani treated with different dilution concentrations of itraconazole eye drops (n=3) The MIC value of itraconazole eye drops was approximately 1.88 μg/ml

图6 光学显微镜下不同质量浓度伊曲康唑滴眼液作用下腐皮镰刀菌的生长情况(×100) 在0.12 μg/ml和0.47 μg/ml浓度作用下,仍可见簇状菌丝存在;在1.88 μg/ml质量浓度作用下,未见明显菌丝形成 A:0.12 μg/ml B:0.47 μg/ml C:1.88 μg/mlFigure 6 Growth of Fusarium solani treated with different concentrations of itraconazole eye drops under a light microscope (×100) The clustered hyphae were still visible at the concentration of 0.12 and 0.47 μg/ml.No obvious hypha formation was observed at 1.88 μg/ml A:0.12 μg/ml B:0.47 μg/ml C:1.88 μg/ml

GO-PEG的抑菌性能结果显示,即使GO-PEG的浓度增加到15.00 μg/ml,腐皮镰刀菌的存活率仍在80%左右,即GO-PEG自身的抗腐皮镰刀菌活性很弱(图7)。这可能是由于GO-PEG带有负电荷,对真菌的细胞壁膜的亲和性不强,因此不具备良好的抗菌活性。

图7 不同倍比稀释浓度GO-PEG处理下腐皮镰刀菌存活率变化(n=3) 不同质量浓度GO-PEG处理后腐皮镰刀菌的存活率均在80%左右Figure 7 Changes in survival rate of Fusarium solani treated with different dilution concentrations of GO-PEG (n=3) The survival rate of Fusarium solani treated with different dilution concentrations of GO-PEG was about 80%

3 讨论

真菌性角膜炎在以农业人口为主的发展中国家的发病率高,治疗棘手[16]。眼部独特的解剖结构,使得眼局部给药受到多重给药屏障,如泪膜、角膜等的限制,眼局部给药的生物利用度极低[17-18]。目前,国际上唯一获批用于真菌性角膜炎的临床药物为那他霉素滴眼液(美国Alcon Laboratories公司),混悬剂型,价格昂贵,仅在治疗浅层角膜真菌感染效果显著[19]。2022年初,那他霉素滴眼液因不符合《中国药典》(2020年版)相关规定,已退出中国市场。因此,寻找和开发新型广谱抗真菌药物和抗真菌剂型是眼科药物工作者亟待解决的问题。

伊曲康唑作为一种三唑类广谱抗真菌药物,广泛应用于临床真菌感染的治疗。然而,高的脂溶性和轻微的刺激性阻碍了其进一步应用。近年来,研究者尝试制备包括纳米、微乳等在内的多种剂型来解决上述问题,但效果均不太理想[20],这与伊曲康唑强疏水性有关,也受到其分子刚性结构的限制,刚性的棒状分子结构限制了纳米制剂的负载能力。

在本研究中,通过对安全无毒副作用的石墨烯进行氧化改性和高分子策略的修饰,制备出水溶性的GO-PEG复合材料。通过扫描电子显微镜、表面电位和拉曼光谱等表征手段,验证了目标材料的成功制备。制备的水溶性GO-PEG具有较大的比表面积以及高效的药物负载潜力,实现了对伊曲康唑的有效负载。伊曲康唑滴眼液药物质量浓度测定结果显示,水溶性GO-PEG载体的最大药物载量高达10 mg/ml,可实现高效率的药物负载(4倍质量当量的药物),相比于伊曲康唑水溶解度(0.001 mg/ml),制备的伊曲康唑滴眼液表观溶解度提高了10 000倍。以上结果表明,所制备的水溶性GO-PEG显示出优越的药物负载能力,显著提高了伊曲康唑的水溶解性。

抗腐皮镰刀菌实验结果显示,制备的伊曲康唑滴眼液的MIC值约为1.88 μg/ml,光学显微镜的真菌形态结果也印证了MIC值的实验结果。而GO-PEG并未表现出强的抗菌活性作用,这可能与较低的电荷有关,材料小于-30 mV的负电位,难以与表面荷载负电的细菌和细胞等结合,从而降低对细胞膜的破坏作用。以上结果表明,GO-PEG实现了对伊曲康唑的有效负载,增加了广谱抗真菌药物伊曲康唑表观溶解度,从而实现伊曲康唑对真菌性角膜炎常见菌种腐皮镰刀菌的有效作用。

综上所述,本研究利用化学方法制备的新型二维石墨烯复合材料可以有效负载强疏水抗真菌药物伊曲康唑,提高制剂的药物含量,从而达到优越的抗真菌效果,为伊曲康唑眼用制剂的设计提供了可行性思路。本研究仍存在一定局限性,如未进行动物模型中的安全性及抗真菌效果评估,且未进行其抗真菌机制的研究,未来需进一步开展细胞和动物实验验证其安全性和有效性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明李景果:参与选题与研究设计、收集数据、资料分析和解释、论文撰写及修改;韩奉奇:参与选题与研究设计、收集数据、资料分析和解释;赵孟阳:参与选题与研究设计、资料分析和解释、论文修改;何继军、梁珍:参与收集数据、资料的分析和解释;张俊杰:参与选题与研究设计、论文修改及定稿