电子鼻技术结合化学计量分析对汉源花椒的鉴别

刘振平 ，张 丹，黄 瑶

（1.重庆安全技术职业学院，重庆 404020；2.四川丁点儿食品开发股份有限公司，四川成都 611732；3.西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039；4.四川家和原味香料有限公司，四川广汉 618323）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是芸香科Rutaceae 花椒属ZanthoxylumL.植物的果实，其干燥成熟的果皮是重要的药食两用植物资源[1]。在食品调味领域，花椒是川菜特色麻味的主要来源，具有增香增色、掩盖异味、防腐保鲜、促进食欲等作用[2]。在医药领域，花椒有降血脂、抗氧化、抑菌抗虫、抗肿瘤细胞增殖等广泛的药理学功能[3]。我国花椒的栽培面积和产量均位于全球首位，全国除东北、内蒙古等地外均有种植，资源丰富[4]。汉源花椒色泽丹红、粒大油重、芳香浓郁、醇麻爽口，深受消费者青睐，位居全国花椒之冠[5]，是中国国家地理标志产品。唐元和年间（806 年～820 年）至清光绪二十七年（1901 年）汉源花椒被列为贡品，因此汉源花椒也被称为“贡椒”[6]。近年来，汉源花椒以其优良品质享誉全国，名扬海外，表现出了巨大的经济效益和文化价值。但由于利益驱使，不法分子以劣质花椒冒充汉源花椒或者将劣质花椒掺入汉源花椒高价销售，扰乱花椒市场秩序，损害消费者利益。因此，建立简便有效的汉源花椒鉴别方法具有重要意义。

风味成分与食品质量之间存在一定的对应关系，基于风味物质的食品质量检测技术发展迅速[7]。风味是花椒质量的重要评价指标，通过对花椒风味成分的分析能够较全面地揭示其质量信息[8]。目前，用于食品风味分析或鉴别主要有感官法[9]、气相色谱与质谱联用法[10]、气相离子迁移谱法[11]及电子鼻法[12]等。感官法主要依靠分析人员对食品风味的感知并结合经验做出判断，简便快捷，但受主观因素影响大；气相色谱与质谱联用法和气相离子迁移谱法设备昂贵、操作繁琐；基于电子鼻技术对食品风味成分分析用于食品类别区分具有简便、快速、准确的优势，已被广泛应用食品的无损检测[13]。

吴莉莉等[14]运用自制电子鼻装置进行了不同花椒品种风味成分分析，结合化学计量学方法实现了对花椒品种的高识别率鉴别，张正武等[15]利用电子鼻PEN3.5 系统实现了对陇南34 个花椒品种准确鉴别，辛松林等[16]通过电子鼻技术对市售花椒油商品进行了准确鉴别，这些研究表明通过电子鼻技术测定和分析风味成分能够实现对花椒及其产品的类别区分。电子鼻检测技术已趋于成熟，设备体积小，便于携带，且自带分析软件，对于样品的分析可在几分钟内完成，操作简便，可实现现场快速检测，但针对汉源花椒的鉴别研究未见报道。

本研究利用电子鼻技术对包括汉源花椒在内的全国6 个不同主要产地的红花椒进行10 个传感器通道的挥发性成分测定，并对数据分别进行了主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、线性判别分析（Linear Discriminate Analysis，LDA）和偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA），构建汉源花椒的鉴别模型，为汉源花椒的中国国家地理标志产品保护及质量评价提供新的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

四川汉源花椒及与汉源花椒外观颜色、颗粒大小类似，从表面难以区分且常用于冒充或掺假的不同产地的红花椒，包括四川康定红花椒、四川盐源红花椒、山东莱芜红花椒、四川丹巴红花椒、甘肃临夏红花椒 由四川家和原味香料有限公司和四川丁点儿食品开发股份有限公司提供，均能保证产地来源准确。

PEN3 便携式电子鼻系统（配有一组10 个金属氧化物传感器） 德国AIRSENSE 公司；JA5003B型电子天平（精度0.001 g） 上海精科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料的处理 分别将不同产地的鲜红花椒样品在40 ℃下干燥24 h，收集干燥果皮。在室温（25±2） ℃条件下，精密称取不同产地干燥的红花椒果皮样品3 g 置于20 mL 的顶空样品瓶中，加盖密封，静置30 min，待顶空样品瓶中富集气体达到平衡后用电子鼻检测。

1.2.2 电子鼻传感器类型和性能 本研究采用的PEN3 便携式电子鼻系统配置的10 个金属氧化物气体传感器，其类型和性能如表1 所示。

表1 电子鼻传感器类型和性能Table 1 Types and performances of electronic nose sensors

1.2.3 电子鼻分析条件 在使用电子鼻检测不同产地红花椒样品时，传感器的信号响应值从101 s 后开始趋于稳定，106 s 后响应值基本不发生变化，达到稳定状态。因此，取111 s 处采集的信号数据用于分析研究。样品的检测参数为：洗气时间180 s，调零时间5 s，样品准备时间5 s，采用顶空进样方法，进样时间120 s，载气为干燥的空气，流速300 mL/min。每类样本设置6 个平行样品，每个样品重复检测3 次[15]。

1.2.4 PLS-DA 模型的建立与验证 采用PEN3 便携式电子鼻系统自带WinMuster 分析程序对测得的6 个不同产地红花椒样品数据进行PCA 和LDA分析。数据经EXCEL 初步处理后，采用Metabo-Analyst-5.0 进行多元数据可视化分析，应用PLSDA 评价样品风味成分与产地的相关性，建立鉴别汉源花椒模型。此外，利用变量投影重要性（Variable Importance for the Projection，VIP）值进行潜在特征类别风味成分的筛选。最后，对掺杂不同比例其他产地红花椒的汉源花椒进行鉴别分析以验证模型的有效性。

2 结果与分析

2.1 电子鼻传感器对不同产地红花椒的响应

本研究采用的PEN3 便携式电子鼻系统配置的10 个金属氧化物气体传感器对6 个不同产地红花椒样品产生信号响应，响应情况如图1 所示，10 个传感器对6 种花椒样品均有响应，尤其W5S、W2W、W1S、W6S 的信号响应明显，说明6 种不同产地红花椒风味成分中氮氧化合物、含硫和含氯的有机化合物、烷烃类化合物、含氢化合物浓度较高。

图1 不同产地红花椒电子鼻10 个传感器信号响应雷达图Fig.1 The radar map of electronic nose 10 sensors signals response for red Zanthoxylum bungeanum from different origins

热图（Heatmap）是一种用颜色变化来反映数据信息的方式，可将数据之间的差异直观的通过颜色深浅表示。如图2 所示，在不同产地红花椒电子鼻10 个传感器信号数据热图中，每一列代表一个样品，每一行代表一种传感器，每个小格代表某个样品中某种传感器检测到的数据，红色越深代表对应样品中的对应传感器响应的风味成分浓度越高，蓝色越深则含量越低。由此，从图中可以看出，汉源花椒中风味成分的10 个传感器的响应数据与其他红花椒明显不同，即汉源花椒中的风味成分与其他5 个不同产地红花椒中风味成分有明显差异，这是建立有效的汉源花椒鉴别模型的重要基础。

图2 不同产地红花椒电子鼻10 个传感器信号数据热图Fig.2 Heat map of electronic nose 10 sensor signals data of red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.2 主成分分析

主成分分析（PCA）是一种常用的有效的多维数据降维分析方法，利用PCA 可将原始众多的特征变量线性变换为低维新特征变量（即几个综合因子），保留了原有特征的主要信息，有利于数据的直观分析[17]。图3 是不同产地红花椒的PCA 结果，从图中可以看出，降维后的新特征变量第一主成分和第二主成分累计贡献率高达97.47%，代表了样品的主要特征信息。图4 是PCA 中电子鼻传感器对不同产地红花椒风味成分响应的载荷图，它反映的是不同位置分布的传感器对PCA 图中分布的不同产地红花椒响应信号的相对强弱，相对位置越近响应越强，相对位置越远响应越弱，例如传感器W5S 和W2W 对汉源花椒的信号响应相对较强，说明它们敏感的风味化合物分布相对集中在汉源花椒中。同时也可以看出传感器W5S 对第一主成分贡献率最大，传感器W2W对第二成分贡献率最大，说明这两个传感器的响应数据对于在PCA 分析中实现汉源花椒与其他产地红花椒的有效区分发挥了重要作用。从图3 可以看出，6 个不同产地红花椒均分布于不同区域，康定红花椒与丹巴红花椒有少部分重叠，这可能与两种红花椒产地距离较近有关，汉源花椒特征明显，与其他5 种红花椒距离较远，说明汉源花椒具有明显的风味特性，电子鼻技术根据这些风味特性差异能够将汉源花椒与其他5 个产地红花椒区分。另外，由于PCA属于无监督的分类方法，仅简单地利用变量数据进行分析，不考虑样本类别输出，在图3 中也可以看出汉源花椒样品间的离散明显，为得到更好的结果，还需要对数据进行进一步分析。

图3 电子鼻传感器对不同产地红花椒响应数据的PCA 得分图Fig.3 PCA score plot of electronic nose sensors response data of red Zanthoxylum bungeanum from different origins

图4 电子鼻传感器对不同产地红花椒响应的载荷图Fig.4 Loading diagram of electronic nose sensors response for red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.3 线性判别分析

对电子鼻10 个传感器类型测得的6 个不同产地红花椒数据进行线性判别分析（LDA）。LDA 是一种有监督的降维且有类别输出的分析技术，其目标是使降维后的数据类内方差最小，类间方差最大，即对数据在低维度上进行投影，投影后同一个类别数据的投影点尽可能接近，而不同类别的数据中心之间的距离尽可能的大。图5 是电子鼻对不同产地红花椒挥发性成分的LDA 图，从图中可以看出，第一主成分和第二主成分总的区分贡献率为87.67%，这两个主成分也基本代表了样品的主要特征信息，汉源花椒所处区域独立于其他5 种红花椒，表明LDA 能够较好地将汉源花椒与其他红花椒区分，同时，汉源花椒平行样品间的离散度较小，类别特征显著。由上可知，本研究构建的基于电子鼻技术的LDA 模型能够实现对汉源花椒的准确鉴别。

图5 电子鼻传感器对不同产地红花椒响应的LDA 图Fig.5 LDA diagram of electronic nose sensors response to red Zanthoxylum bungeanum from different origins

2.4 PLS-DA“是-否”鉴别模型构建

为了建立更直观、更简便的汉源花椒鉴别模型，我们引入了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）的理论与方法对基于电子鼻技术测得的不同产地红花椒数据进行深入分析与挖掘。PLS-DA 是一种有监督的降维判别分析方法，其数学原理是将变量数据与分类信息划分为两组数据集，通过投影与判别计算，借助分组信息挖掘组间差异进而将每一组样本区分。本研究在进行分析前，首先将样品数据分为汉源花椒和其他产地红花椒两类以便建立更直观的汉源花椒“是-否”鉴别模型，其次对数据进行了指数转换归一化和Auto Scaling 标准化，以消除或减少背景造成的干扰以及与实验原始数据的不必要偏差。图6 为汉源花椒PLS-DA 鉴别模型的二维得分图，从图中可以看出汉源花椒与其他红花椒所在的区域均相对独立，说明汉源花椒与其他产地红花椒的特征差异非常明显，以此为依据能够较好的将汉源花椒与其他产地红花椒分开，实现汉源花椒的有效鉴别。

图6 汉源花椒与其他产地红花椒鉴别PLS-DA 得分图Fig.6 PLS-DA score diagram for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification from other geographical origin

内部交叉验证（Cross Validation，CV）是小样本模型常用的验证方法，并将预测能力参数（Q2）和拟合优度值（R2）作为评价模型性能的指标[18]，Q2和R2分别代表模型的预测能力和解释效果，Q2通过交叉验证计算，即：

PRESS 为验证过程中所有样本的预测残差平方和。在模型质量评价中Q2比R2更重要，Q2的极限值为1，一般认为Q2＞0.4 表示所建模型是可接受的有效模型[19]。R2是Q2经交叉验证前的值，它表示模型预测值（）与实际值（y）的适应度，计算公式如下：

随着潜在变量的增加，R2逐渐接近1。本研究的交叉验证结果如图7 所示，Q2和R2分别为0.947和0.968，表明所构建的汉源花椒鉴别模型是有效的。

图7 汉源花椒鉴别模型交叉验证结果Fig.7 Results of cross verification for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification model

置换验证通过执行随机安排的样本数据，Ydata 的位置随机移位，以不同的顺序出现[20]，然后统计推断，可增加模型中的样本数量，因此特别适用于样本较少的模型[21]。在本研究构建的汉源花椒鉴别模型使用的 MetaboAnalyst-5.0 平台中，置换模拟验证只要能推测出“只有极少数（5%）置换模拟的Q2值比当前的Q2值大”即可认为是没有出现过拟合。本研究100 次置换验证的结果如图8 所示，置换模拟中Q2值比当前的Q2值大的概率（P）均小于0.01，表明所构建的PLS-DA 模型未出现过拟合，稳健有效。

图8 汉源花椒鉴别模型置换验证结果Fig.8 Results of permutation verification for Hanyuan Zanthoxylum bungeanum identification model

在PLS-DA 模型中，变量投影重要性（Variable Importance for the Projection，VIP）值是评估各特征变量在类群区分中贡献大小的重要参数，主要用于揭示特征变量与聚类分析的相关性[22]。一般情况下，VIP 值大于1 的变量被认为是潜在特征变量，VIP 值越大的特征变量对于聚类鉴别模型有效性的贡献就越大[23-24]，一个X 变量VIP 值的计算方法如下：

其中VIPj表示第j 个变量的VIP 值，p 为X 变量的数量，k 是h 个潜变量中的第k 个潜变量，ck为第k 个潜变量的回归权值，wjk是X 变量的权矩阵w 的第k 列的第j 个元素[21]。本研究PLS-DA 模型的VIP 值如图9 所示，VIP 值大于1 的变量分别为W6S、W3C、W3S、W1C、W5C 和W2S，这些变量代表的是对相应传感器响应的风味成分，即含氢化合物、芳香类成分及氨类、脂肪族烷烃类化合物、芳香成分及苯类、短链烷烃芳香类成分、醇类及醛酮类化合物。以上结果表明，这几类化合物是汉源花椒与其他产地红花椒具有显著差异的重要特征变量，在汉源花椒鉴别中发挥着关键作用。

图9 PLS-DA 鉴别模型VIP 值Fig.9 VIP value of PLS-DA identification model

2.5 掺杂鉴别验证

为了验证本研究建立的汉源花椒鉴别模型的有效性，在汉源花椒中掺入等比例混合的四川康定红花椒、四川盐源红花椒、山东莱芜红花椒、四川丹巴红花椒、甘肃临夏红花椒，掺杂比例分别为5%、10%、30%及50%，各掺杂比例分别设置6 个平行样品，在相同的条件下测定电子鼻响应数据，将测得数据用已建立的LDA 和PLS-DA 鉴别模型分析。分析结果为24 个掺杂的汉源花椒样品均未被判定为汉源花椒，这表明本研究构建的基于电子鼻技术的LDA 和PLS-DA 鉴别模型能够实现对汉源花椒5%以上比例掺杂的准确鉴别。

3 结论

电子鼻技术在食品分析中应用广泛，设备简单，容易携带，操作简便。风味成分组成是香辛料质量的关键指标，基于电子鼻技术的风味成分分析对于香辛料的质量评价与其他种类食品相比有更明确的目标靶向性。本研究运用电子鼻技术对中国国家地理标志产品汉源花椒及其他5 个不同产地的红花椒进行了10 个传感器通道的风味成分测定，并采用PCA、LDA 和PLS-DA 的理论与方法进行分析，构建了能够将汉源花椒与其他5 种红花椒区分的鉴别模型。同时，利用掺杂比例分别为5%、10%、30%及50%的汉源花椒样品对LDA 和PLS-DA 模型的有效性进行了验证，验证结果表明所构建模型能够实现对各掺杂比例的汉源花椒的准确鉴别，为汉源花椒的中国国家地理标志产品保护、质量控制和产地溯源提供了新的技术参考。另外，通过VIP 值分析得到的对于汉源花椒鉴别具有关键作用的含氢化合物、芳香类成分及氨类、脂肪族烷烃类化合物、芳香成分及苯类、短链烷烃芳香类成分、醇类及醛酮类化合物，为后续通过靶向目标物进行红花椒产地鉴别研究奠定了基础。