新医学科学与技术综合实验设计：光热-光动力协同抗菌纳米涂层制备

＊邱云峰 李信哲 陈歌辉 惠建博 果崇申 刘绍琴*

（1.哈尔滨工业大学医学与健康学院 黑龙江 150080 2.哈尔滨工业大学化工与化学学院 黑龙江 150001）

钛合金凭借其优异的生物相容性、机械强度、耐腐蚀性等优点已经广泛用作骨骼、关节、牙齿等替代物。然而钛植入物表面由于细菌粘附极易引发细菌感染，造成植入失效或面临二次手术，已经发展成为临床上亟待解决的医学难题[1]。基于此，钛植入物表面抗菌纳米涂层制备是近年来纳米医学领域的重要研究热点之一[2]。

无机纳米抗菌剂具有广谱抗菌性能，可以杀灭耐药细菌[3]。研究发现光热-光动力、光热-化疗等联合疗法比单独疗法具有更优异的协同抗菌效果，可以减少药物用量和高热对正常组织的损伤[4]。在钛植入物表面制备联合抗菌涂层是纳米医学领域重要的发展方向，但是目前高校在相关领域的教学中主要依赖于科技前沿导论等理论课程，即使开设抗菌类实验也仅仅是围绕平板计数法等实验操作，忽视与国际研究热点的联系[5-6]。遵循此思路，有必要将联合抗菌纳米涂层引入到本科实验教学中，提高学生的科研创新能力，把握前沿学术方向[7]。本综合实验抗菌涂层制备工艺成熟便捷，实验参数容易控制，学院分析测试技术平台和微生物平台完善，实验周期较短，适合本科生的专业实验教学。

1.实验目的

（1）了解光热效应和光照产生活性氧物种的原理。（2）掌握聚多巴胺/Ag@AgCl涂层的制备方法。（3）了解XRD、SEM、FTIR等设备结构、原理和使用方法。（4）掌握抑菌性能研究方法。

2.实验原理

（1）聚多巴胺的光热治疗抗菌原理。聚多巴胺是一种具有近红外吸收特性的仿生高分子材料，在弱碱性水相条件下即可发生自聚合反应，具有优异的生物安全性。其光热转换效率可以高达40%，远远大于文献中广泛使用的金纳米棒（20%）。聚多巴胺可以迅速将光能转化为热能破坏细菌细胞膜，进而杀灭细菌[8]。并且对于已经形成生物被膜的结构也可以利用高热破坏外层菌膜结构杀灭深层细菌。基于此物理杀菌机制可以避免耐药细菌的产生。

（2）Ag@AgCl光动力治疗抗菌原理。光敏剂在特定波长的光激发下，激发态的光敏剂将能量传递给周围的O2分子形成高活性氧物种,引起细菌氧化应激，导致细菌死亡。光动力杀菌技术能够选择性地治疗局部感染病灶，对健康组织和周边细胞损害小。Ag@AgCl包含AgCl半导体（带隙：3.25eV）光吸收和Ag的表面等离激元共振吸收，吸收光谱范围覆盖可见区到近红外波段，可以在光激发下产生活性氧物种，已经广泛用于光动力抗菌和抗肿瘤等。

（3）聚多巴胺/Ag@AgCl涂层的光热-光动力协同抗菌原理。光热效应显著改变细菌细胞膜的通透性，光动力生成的ROS可以更加容易的进入到细菌的内部，造成DNA损伤和蛋白质变性，大量蛋白质等流失后引起细菌的死亡。因此光热-光动力协同抗菌剂可以比单一抗菌疗法具有更加优异的抗菌效果。

3.实验仪器

（1）实验试剂。医用钛片、硝酸银、盐酸多巴胺、Tris-HCl、蒸馏水、氢氧化钾、肉汤、琼脂、pH试纸、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、Syto 9绿色荧光染料和碘化丙啶（PI）。

（2）实验仪器。烧杯、锥形瓶、移液枪、磁力加热搅拌器、烘箱、XRD、SEM、FTIR、CLSM、近红外光源激光器、红外摄像仪、超声波清洗器、洁净台、灭菌锅、紫外灯、酒精灯、涂布棒。

（3）实验表征。采用Quanta 200FEG型号SEM表征钛片形貌。通过PANalytical Empyrean型号XRD测定结构。采用赛默飞FTIR表征聚多巴胺分子结构。采用菲利尔E8红外成像仪测试光热转换温度。采用808nm近红激光器进行抗菌性能研究。采用尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜观察活死细胞。

4.实验过程

（1）医用钛片的表面处理。将1mm厚度钛片裁剪为1cm×1cm，乙醇和水分别超声清洗5min待用。配置4mol/L氢氧化钾水溶液50mL，将上述钛片浸入装有碱液的烧杯中，室温刻蚀24h，反应结束后用大量去离子水清洗去除表面残留，pH试纸测试水溶液pH为7左右，放入50℃烘箱烘干。采用SEM观察碱刻蚀钛片形貌。如图1所示，4mol/L碱溶液可以在钛片表面刻蚀多孔纳米结构。

图1 （a）纯水和（b）4mol/L氢氧化钾溶液刻蚀医用钛片表面的SEM图

（2）聚多巴胺/Ag@AgCl涂层。将0.05g多巴胺盐酸盐和0.05g AgNO3加入到7mL Tris-HCl缓冲溶液（pH8.5，0.01mol/L）中，将多孔钛片浸泡在上述混合溶液，连续机械搅拌24h，获得聚多巴胺/Ag@AgCl。通过XRD进行测定结构。采用FTIR表征聚多巴胺的酰胺基、芳香环和邻苯二酚中羟基官能团的伸缩振动。

（3）光热性能评价。激光功率（1W/cm2），距离10cm，使用热成像仪每分钟记录温度变化和热图像，辐照时间20min，利用Origin软件绘制曲线。如图2所示，在808nm激光辐照下温度逐渐升高，20min后温度达到56.5℃，高于对照组。

图2 （a）涂层修饰钛片在激光辐照下的热成像图；（b）纯水、钛片和涂层修饰钛片升温曲线

（4）光热-光动力抗菌性能和机理研究。使用灭菌锅对锥形瓶、肉汤和琼脂培养基等进行灭菌。选择革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性菌（大肠杆菌）作为研究对象，复苏冷冻细菌，将对数期菌悬液稀释至108CFU/mL待用。选择24孔板作为反应器，将50μL细菌培养物加入450μL肉汤中，将修饰涂层的钛片浸泡在上述肉汤中，37℃条件下培养6h。使用808nm激光辐照，采用红外热像仪监测温度。杀菌完成后，将对照组和实验组的菌悬液稀释，琼脂板37℃培养12h。采用ImageJ软件对菌落计数，实验平行三次。如图3所示，涂层修饰钛片表面菌落数目最少，其抑菌率为99.7%，远远大于无光照组，以及光照纯钛片和聚多巴胺修饰钛片对照组。

图3 （a）钛片和涂层修饰钛片表面在光照下大肠杆菌落生长情况（b）钛片、聚多巴胺修饰钛片和涂层修饰钛片的抑菌率

使用移液枪称取荧光染料滴加到PBS溶液中，将染料滴加到覆盖菌落的钛片，避光吸附15min，冲洗3次，利用激光共聚焦显微镜表征活死细菌。抗菌实验结束，4%多聚甲醛溶液低温固定，乙醇梯度脱水10min，自然晾干，喷金处理后测试SEM。

（5）其它协同抗菌涂层的制备方法。为了提高学生抗菌纳米涂层研发能力，除了上述聚多巴胺/Ag@AgCl涂层，鼓励学生分组设计抗菌涂层，例如选择碳材料、半导体等抗菌材料，通过调研文献，撰写实验方案和实验可行性分析，依据光热-光动力基本原理，设计抗菌涂层，对比抗菌效果，总结设计规律和抗菌机制，为研究生阶段的科研课题设计打下坚实的理论基础。

5.实验教学内容设计

(1)实验前准备

本实验涉及材料、抗菌、表征等多个领域的基础知识，将提前2周安排学生查阅光热-光动力抗菌研究的文献，并建议学生掌握以下知识：①了解钛片碱刻蚀、聚多巴胺合成和Ag@AgCl制备方面的知识；②了解光热治疗和光动力治疗的原理；③了解耐药菌的产生机制以及杀灭耐药菌的主要方法；④了解活死细菌染色机理；⑤了解仪器和制图软件的原理和操作方法。

(2)实验课程安排

本综合实验拟为医学与健康学院的新医学科学与技术综合实验开设，累计72学时，本部分16学时，4～6人一组。为保障实验顺利进行，每次操作至少2人在场，教师现场指导，共同完成实验。

具体安排如下：①理论课2学时。讲授钛片刻蚀原理、聚多巴胺形成机制、一步法制备Ag@AgCl原理、光热和光动力抗菌原理、活死细菌染色和死菌表征方法。②钛片预处理2学时，包括清洗钛片、配置碱液、称量药品等。③聚多巴胺/Ag@AgCl涂层修饰钛片制备2学时，包括配置Tris溶液、称量药品、准备搅拌器等。④形貌和组成表征3学时。大二本科生通过大学生科创项目熟悉常用表征设备，根据准备样品、上机操作等安排3学时。⑤抗菌研究7学时。根据器皿灭菌、制备琼脂、细菌复苏、光照等安排7学时。⑥实验结束后2周以内上交实验论文。包括原理、图表和分析、结论、创新点、文献等内容。

(3)思考题

设计如下问题供学生思考：①为什么要设计协同抗菌纳米催化剂？②单质Ag的作用是什么？③除了聚多巴胺/Ag@AgCl涂层，还可以设计哪些新颖的协同抗菌剂？

6.结束语

本综合实验通过理论和实验教学的有机结合，实现了光热-光动力协同抗菌纳米材料的应用。在本实验中，通过文献调研，使学生们了解抗菌纳米材料的前沿进展，培养学生们查询文献、整理资料、总结前沿热点的能力。本实验中聚多巴胺在碱性条件下就可以聚合，并且使用的化学试剂包含氯离子，可以同时制备Ag@AgCl，一步法就可以方便的在钛片表面形成稳定的纳米抗菌涂层，制备方法简便可控，适合本科生教学实验。在抗菌性能研究和材料表征过程中，学生们的理论知识可以在实践操作中得到有效的检验，有利于提高学生的科研创新能力。