丙醇二酸降低秀丽隐杆线虫体内脂肪含量的研究

刘晓颖　王润圆　徐芳　张梦媛　邹伟　王琦

摘 要：目的：探索丙醇二酸对秀丽隐杆线虫体内脂肪的影响及调节机制。方法：在NGM培养基中加入不同浓度丙醇二酸饲养线虫，油红O和尼罗红染色法展示线虫体内脂肪颗粒大小、数量和相对脂肪含量，测定线虫身体摆动频率、吞咽频率、48 h存活率、身宽、体长等指标。QPCR检测fat-1至fat-7、sbp-1和nhr-49基因相对表达量，荧光显微镜观察FAT-6：GFP、FAT-7：GFP荧光强度的变化。结果：10、50、100 μg/mL丙醇二酸处理对线虫脂滴大小无影响，脂肪颗粒数量降至对照组的0.69、0.53、0.54倍，相对脂肪含量降至0.87、0.81、0.80倍。此外，身体摆动频率、吞咽频率、48 h后存活率和体长无显著差异，身宽分别降至53.11、57.01、56.03 μm。FAT-6：GFP、FAT-7：GFP荧光强度无明显变化，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因转录水平无明显变化，fat-2、fat-3、fat-4基因转录水平分别降至0.69、0.77、0.24倍。结论：丙醇二酸可降低秀丽隐杆线虫体内脂肪，但不影响运动、吞咽等行为。降脂的调控不依赖于油酸转化，推测通过降低fat-2、fat-3、fat-4基因转录使得多不饱和脂肪酸（PUFAs）减少导致脂肪含量降低。

关键词：秀丽隐杆线虫；丙醇二酸；脂肪代谢；基因转录

丙醇二酸是从节瓜中提取出的一种活性物质［1］，属于小分子有机酸。在人体中，丙醇二酸通过抑制糖转化为脂肪从而减少脂肪堆积［2］。然而，人体自身不能合成丙醇二酸，需通过饮食获取。节瓜等少数果蔬中含有丙醇二酸，是植物有机型丙醇二酸的重要来源［3-4］。随着人们生活水平的提升、健康意识的增强，越来越注重节瓜在美容、减肥方面的作用，节瓜的需求量逐年增加［5］。秀丽隐杆线虫以其良好的遗传学特征和高度保守的脂质代谢途径成为肥胖研究中的动物模型［6］，已被广泛用于食品生物活性成分的营养评价，尤其是在脂肪代谢和长寿领域［7］。与哺乳动物类似，秀丽隐杆线虫不仅含有一系列脂肪酸，如饱和和不饱和脂肪酸，而且能将吸收的膳食营养素转化为脂肪酸［8］。更重要的是，许多对调节人类脂质代谢至关重要的成分是保守的［9］，如NHR-49/MDT-15系统具有调节哺乳动物和哺乳动物能量平衡的类似功能。秀丽隐杆线虫具有一个固醇反应元件，能够结合蛋白同源物SBP-1，它不仅是该生物体内脂肪酸合成的关键调节器，而且也是哺乳动物脂肪的关键转录调节器。线虫缺乏哺乳动物体内的专用脂肪细胞，它将脂肪以液滴形式储存在肠道和皮下细胞中，可通过脂溶性染料（如油红O和尼罗红）进行观察［10-11］。在此，以秀丽隐杆线虫为模式生物，全面评估丙醇二酸对脂肪积累的影响及其潜在机制。本研究将为促进丙醇二酸作为一种减少脂肪积累的营养保健品的发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丙醇二酸，上海生工生物工程有限公司；RNA提取试剂盒，上海普洛麦格生物产品有限公司；CDNA合成试剂盒，北京天根生化科技有限公司；SYRB，美国MedChemExpress 公司；尼罗红、油红O染料，美国Sigma-Aldrich公司；QPCR引物，由上海生工生物工程有限公司进行合成。

1.2 仪器与设备

Ts2R倒置荧光显微镜，日本Nikon公司；TADVANCED PCR仪，德国Biometra公司；Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪，德国Eppendorf公司；Allegra X-低温高速离心机，美国贝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 秀丽隐杆线虫培养 N2野生型线虫、FAT-6：GFP和FAT-7：GFP线虫由云南生物资源保护与利用国家重点实验室馈赠。野生型N2和突变株在NGM（50 mmol/L NaCl，20 g/L琼脂，2.5 g/L蛋白胨，1.0 mmol/L胆固醇，1.0 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgSO4，25 mmol/L磷酸二氢钾，pH 6.0）上用标准方法在20 ℃营养良好的大肠杆菌OP50上培养至尚未产卵的成年阶段。

1.3.2 油红O和尼罗红染色 秀丽隐杆线虫将脂肪以液滴形式储存在肠道和皮下细胞中，可通过脂溶性染料油红O和尼罗红进行染色观察，具体染色方法参照文献［12］。

1.3.3 身体摆动频率、吞咽频率测定 将同步化后的线虫加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培养基中，生长至未产卵成虫期后，将线虫用M9沖洗3次，然后吸取约30条虫在显微镜下计录1 min身体摆动次数。吸取约30条虫至OP50平板上，超净工作台中吹干后，计录每条虫1 min咽泵次数。

1.3.4 线虫48 h后存活率的检测 将同步化后的线虫（约50条）加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培养基中，生长至未产卵成虫期后，显微镜下观察存活情况。

1.3.5 身宽、体长的测定 将同步化后的线虫加入含有0、10、50、100 μg/mL丙醇二酸的NGM培养基中，生长至未产卵成虫期。将线虫用M9冲洗3次后，吸取约30条虫在显微镜下用其自带软件测定身宽、体长。

1.3.6 FAT-6：GFP和FAT-7：GFP荧光观察 将FAT-6：GFP、FAT-7：GFP L1期线虫转移至含丙醇二酸0、10、50、100 μg/mL的NGM培养基中培养至成虫。M9洗下后吸取15 μL制片，在荧光显微镜下观察，每次观察30条虫，Image J对荧光强度进行定量分析，实验重复3次。

1.3.7 QPCR分析 收集成虫，按标准方法提取总RNA，并测定其含量。根据RNA含量，按逆转录试剂盒步骤合成cDNA，使用罗氏荧光定量PCR仪进行基因转录水平测定。以act-1为内参基因，用2-ΔΔCt计算转录水平差异，引物序列见表1。

1.3.8 数据处理及分析 使用GraphPad 8.4.0版本软件对数据进行作图和统计学分析，t检验进行两两比较，单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 丙醇二酸降低秀丽隐杆线虫体内脂肪积累

脂滴储存在秀丽隐杆线虫肠道和皮下细胞中，大小在50～3 000 nm之间。油红O和尼罗红染色测定线虫体脂，评估丙醇二酸对脂肪水平的影响。尼罗红染色结果显示，与WT（对照组）相比，10、50、100 μg/mL丙醇二酸处理线虫脂滴大小接近1.5μm，无明显差异（P>0.05，图1A、C），脂肪颗粒数量差异明显，分别降至对照组的0.69、0.53、0.54倍（P<0.05，图1A、E）。此外，油红O染色中，相对脂肪含量也分别显著降低至0.87、0.81、0.80倍（P<0.05，图1B、D）。这些结果表明，丙醇二酸在减少线虫脂肪积累方面具有高效性。

2.2 丙醇二酸处理线虫部分指标变化

由表2可见，WT（对照组）身体摆动频率、吞咽频率分别为60.42、150.25次/min。各剂量组与对照组相比，身体摆动频率、吞咽频率无显著差异（P>0.05）。测定线虫L1～L4时期发育48 h后存活率，WT及丙醇二酸处理组存活率均为100%。此外，10、50、100 μg/mL丙醇二酸处理，线虫体长无明显差异，身宽分别降至53.1、57.01、56.03 μm（P<0.05，表2）。综上表明，丙醇二酸对线虫无明显毒性，不影响线虫的运动和吞咽。不同浓度丙醇二酸不影响线虫的身长，但均显著降低体宽，这可能与其降低线虫体内脂肪含量有关。

2.3 丙醇二酸不影响线虫体内油酸的转化

线虫基因组共包含3个SCD基因（fat-5、fat-6、fat-7）能够将饱和脂肪酸棕榈酸（C16∶0）和硬脂酸（C18∶0）转化为棕榈油酸（C16∶1n-7）和油酸（C18∶1n-9）［13］。其中fat-5将棕榈酸（C16：0）转化为棕榈油酸（C16：1n-7），而fat-6和fat-7均将硬脂酸（C18：0）转化为油酸（C18∶1n-9）［14］。为确定丙醇二酸是否参与调节线虫体内油酸的转化从而降低脂肪含量，检测了FAT-6：GFP和FAT-7：GFP荧光强度变化。与WT（对照组）相比，10、50和100 μg/mL丙醇二酸处理，FAT-6：GFP、FAT-7：GFP荧光强度无明显变化（图2A、B）。Image J对线虫荧光强度进行定量分析，不同浓度丙醇二酸处理线虫FAT-6：GFP、FAT-7：GFP荧光数值无显著差异（P>0.05，图2C、D）。同时，QPCR检测fat-6、fat-7基因转录水平，均不影响基因转录（图2E）。结果表明，丙醇二酸不影响线虫体内油酸的转化，其对降脂的调控依赖于对其他基因的调控。

2.4 丙醇二酸对PUFAs合成相关基因的影响

研究发现，7种脂肪酸去饱和酶（FAT-1至FAT-7）在秀丽线虫多不饱和脂肪酸（PUFAs）生物合成过程中发挥重要作用［15］。其中，fat-1基因编码n-3去饱和酶，将n-6 LA和γ-亚麻酸转化为n-3 ALA和硬脂酸SDA。fat-2基因编码Δ12酶，将底物n-9 OA生物合成为n-6 LA［16］。fat-3基因编码Δ6去饱和酶，fat-4基因编码Δ5去饱和酶，参与C20-PUFAs生物合成。与哺乳动物一样，线虫也具有Δ9脂肪酸去饱和酶，该酶由fat-5、fat-6、fat-7三个基因编码，从饱和脂肪酸（SFA）中生产多不饱和脂肪酸（MUFA）。nhr-49和sbp-1调控SCD基因fat-5、fat-6、fat-7的表达［17］。为筛选丙醇二酸作用于PUFAs合成的靶基因，对多不饱和脂肪酸合成相关基因的转录水平进行检测。其中，nhr-49、sbp-1、fat-1、fat-5、fat-6、fat-7基因转录水平无明显变化（P>0.05）（图2E、表3），fat-2、fat-3、fat-4基因转录水平分别降至0.69、0.77、0.24倍（P<0.05，表3）。文献报道fat-2基因突变，OA大量增加，PUFAs减少导致脂滴含量降低，fat-3基因突变脂滴含量略有降低［18］。基于此，推测丙醇二酸处理线虫降低fat-2、fat-3、fat-4基因转录，PUFAs减少导致脂滴含量降低，其调控的分子机制有待于进一步研究。

3 讨论

哺乳动物中，不同的脂质在不同的器官系统中具有多种功能，从而对包括发育和生殖在内的大多数生物过程中的脂肪酸信号的理解变得复杂。无脊椎动物模型秀丽隐杆线虫由于其简单的解剖结构，以及廣泛的分子、正向和反向遗传操作，成为发现新的功能和调节脂质代谢的理想工具［19］。丙醇二酸是否会影响线虫生物学行为，是否也有减脂作用有待研究。与人类在专用脂肪组织中储存脂肪不同，线虫利用肠道和皮下细胞储存脂质。尽管有这些差异，但在RNAi筛选中发现了许多改变脂肪储存的基因，其中包括在哺乳动物脂肪新陈代谢中发挥作用的同系物。此外，许多途径，如胰岛素信号通路，不仅能够调节哺乳动物的脂肪储存，也能调节线虫的脂肪储存［20-21］。秀丽隐杆线虫具有乙酰辅酶a羧化酶和脂肪酸合酶，作为脂肪酸生物合成的关键酶。研究表明，几种酶在秀丽线虫PUFAs生物合成过程中发挥重要作用，如7种脂肪酸去饱和酶FAT-1至FAT-7、3-酮酰辅酶a还原酶LET-767和脂肪酸延长酶LRT-1［15］。Δ12去饱和酶FAT-2突变体含有大量的OA，而只有1%的多不饱和脂肪酸，导致许多缺陷，与野生型线虫相比，幼卵体积缩小（29%）、孵化率降低（19%）、生长缓慢、运动不协调、脂滴含量显著减少［18］。在此，以秀丽隐杆线虫为模式生物，全面评估丙醇二酸对脂肪积累的影响及其潜在机制。丙醇二酸在减少线虫脂肪积累方面具有高效性，对线虫无明显毒性，不影响线虫的运动和吞咽。丙醇二酸不影响线虫体内油酸的转化，也不降低fat-2、fat-3、fat-4基因转录。PUFAs减少导致脂滴含量降低，其调控的分子机制有待于进一步研究。

参考文献

［1］刘政国，王鹏，陈勇.节瓜果实发育过程中营养成分含量的变化［J］.中国蔬菜，2014（8）：30-33.

［2］高洁，秦智伟，周秀艳，等.黄瓜高丙醇二酸含量种质资源筛选［J］.中国蔬菜，2012（22）：30-34.

［3］由玉卿，秦智伟，周秀艳，等.黄瓜果实中丙醇二酸含量的配合力分析［J］.北方园艺，2014（10）：19-21.

［4］康德贤，卢发仕，黎键湧，等.广西节瓜春提早高效栽培技术［J］.长江蔬菜，2017（22）：55-57.

［5］周胜军，陈新娟，朱育强，等.我国冬瓜和节瓜种质资源的研究现状及建议［J］.植物遗传资源学报，2014，15（1）：211-214.

［6］Arnold C，Konkel A，Fischer R，et al.Cytochrome P450-dependent metabolism of omega-6 and omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids［J］. Pharmacological Reports Pr，2010，62（3）：536-547.

［7］Tiwary E，HU M，Miller M A，et al.Signature profile of cyclooxygenase-independent F2 series prostaglandins in C.elegans and their role in sperm motility［J］.Scientific Reports，2019，9（1）：11750.

［8］Lemieux G A，Liu J，Mayer N，et al.A whole-organism screen identifies new regulators of fat storage［J］.Nature Chemical Biology，2011，7（4）：206-213.

［9］Jones K T，Ashrafi K.Caenorhabditis elegans as an emerging model for studying the basic biology of obesity［J］. Disease Models and Mechanisms，2009，2（5-6）：224-229.

［10］SHEN P，YUE Y，Park Y.A living model for obesity and aging research：caenorhabditis elegans［J］. Critical Reviews in Food Science & Nutrition，2016，58（5）：741-754.

［11］ZHANG X，LI W，TANG Y，et al.Mechanism of pentagalloyl glucose in alleviating fat accumulation in Caenorhabditis elegans［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2019，67（51）：14110-14120.

［12］王潤圆，赵歆，张梦媛，等.外源添加L-苹果酸降低秀丽隐杆线虫体内脂肪含量［J］.中国食物与营养，2021，27（12）：9-15.

［13］HE B，ZHANG J，WANG Y，et al.Identification of cytochrome b 5 CYTB-5.1 and CYTB-5.2 in C.elegans：evidence for differential regulation of SCD［J］.Biochim Biophys Acta，2017，1863（3）：235-246.

［14］CHANG C，HARRISON X，HSU F，et al.N-（l-Glutamyl）-l-Selenomethionine inhibits fat storage via the stearoyl-CoA desaturases fat-6 and fat-7 and the selenoprotein TRXR-1 in Caenorhabditis elegans［J］. Molecular Nutrition & Food Research，2019，63（4）：1800784.

［15］Mokoena N Z，Sebolai O M，Albertyn J，et al.Synthesis and function of fatty acids and oxylipins，with a focus on Caenorhabditis elegans［J］. Prostaglandins & Other Lipid Mediators，2020，148（4）：106426.

［16］WANG M，CHEN H，GU Z，et al.ω3 fatty acid desaturases from microorganisms：structure，function，evolution，and biotechnological use［J］. Applied Microbiology & Biotechnology，2013，97（24）：10255-10262.

［17］Machado M L，Arantes L P，Gubert P，et al.Ilex paraguariensis modulates fat metabolism in Caenorhabditis elegans through purinergic system （ADOR-1）and nuclear hormone receptor （NHR-49）pathways［J］. PLoS One，2018，13（9）：e0204023.

［18］YI Y H，CHIEN C H，CHEN W W，et al.Lipid droplet pattern and nondroplet-like structure in two fat mutants of Caenorhabditis elegans revealed by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy［J］. Journal of Biomedical Optics，2014，19（1）：11011.

［19］ZHANG H，Abraham N，KHAN L A，et al.RNAi-based biosynthetic pathway screens to identify in vivo functions of non-nucleic acid-based metabolites such as lipids［J］. Nature Protocols，2015，10（5）：681.

［20］Ashrafi K，CHANG F Y，Watts J L，et al.Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes.［J］. Nature，2003，421（6920）：268-272.

［21］Watts J L，Ristow M.Lipid and carbohydrate metabolism in Caenorhabditis elegans［J］. Genetics，2017，207（27）：413-446.

Research on Hydroxymalonic Acid Reduce Body Fat Content in Caenorhabditis elegans

LIU Xiao-ying，WANG Run-yuan，XU Fang，ZHANG Meng-yuan，ZOU Wei，WANG Qi

（School of Public Health，Kunming Medical University，Kunming 650500，China）

Abstract：Objective To explore hydroxymalonic acid on the influence of body fat and regulating mechanism in C.elegans.Method Nematodes were feed on the NGM culture medium with different concentration of hydroxymalonic acid，Oil red O and Nile red staining were used to show the size，number and relative fat content of fat particles in nematodes.At the same time，Body swinging frequency，swallowing frequency，48 h survival rate，body width and length were measured.The relative expressions of fat-1 to fat-7，sbp-1 and nhr-49 genes were detected by QPCR，and the changes of fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP were observed by fluorescence microscope.Result Result showed that 10，50，and 100 μg/mL hydroxymalonic acid treatment had no effect on lipid droplets size，but fat particles number dropped to 0.69，0.53，and 0.54 times，relatively fat decrease to 0.87，0.81，and 0.80 times.In addition，There was no significant difference in body swing frequency，swallowing frequency，survival rate and body length after 48 hours.Nevertheless body width respectively dropped to 53.11，57.01 and 56.03μm.The fluorescence intensity of FAT-6：GFP and FAT-7：GFP did not change significantly，and the transcriptional levels of nhr-49，sbp-1，fat-1，fat-5，fat-6 and fat-7 genes has no obvious change，but fat-2，fat-3，fat-4 gene transcription level dropped to 0.69，0.77，and 0.24 times respectively.Conclusion Hydroxymalonic acid reduced the body fat of Caenorhabditis elegans，but did not affect the behavior of exercise，swallowing and so on.The regulation of lipid lowering does not depend on oleic acid transformation.It is speculated that the decrease of polyunsaturated fatty acids （PUFAs）leads to the decrease of fat content by reducing the transcription of fat-2，fat-3 and fat-4 genes.

Keywords：Caenorhabditis elegans；hydroxymalonic acid；fat metabolism；gene transcription

基金項目：云南省基础研究计划（昆医联合专项）（项目编号：2018FE001-309、2019FE001-177）。

#并列第一作者：刘晓颖（2000— ），女，在读硕士研究生，研究方向：营养及食品安全检测；王润圆（1995— ），女，在读硕士研究生，研究方向：营养及食品安全检测。

*共同通信作者：邹伟（1988— ），男，博士，讲师，研究方向：生物分析与检测；王琦（1976— ），女，博士，教授，研究方向：营养及食品安全检测。