栎属植物组织培养研究现状

罗珍珍 张婵婵 刘潇阳 高 瑞

（1榆林市林木种苗工作站，陕西榆林 719000；2榆林市林业科学研究所，陕西榆林 719000；3榆林市草原工作站，陕西榆林 719000；4麻黄梁黄土地质公园开发建设中心，陕西榆林 719000）

栎属树种种类丰富，分布范围广，具有重要的生态价值和经济价值。广义的栎属包括青冈亚属，狭义的栎属仅包括栎亚属，即Camus[1]定义的栎亚属，中国分布有60余种[2]。栎属植物分布于我国各地，普遍为森林组成树种[3]。栎属树种普遍具有良好的木材品质，可以用于家具或作为优质建材使用，其果实、叶片还可用作饲料等[4]。栎树在工业原料、生态恢复、家具用材、环境美化等方面有显著的功效及经济价值。

根据统计，运用组织培养技术已获得1 500多种的再生植物，累计130 多科[5]，其中有涵盖了果树的400多种的木本植物，且数量依旧在不断递增[6]。组织培养已被应用于栎属植物的多个物种（见表1）。

表1 部分栎属植物组织培养情况

1 外植体选取

组织培养合理挑选外植体是特别重要的一步，需要挑选有较强分化能力的材料，进而确保可以成功进行组培。造成组培植物生理形态差异的因素主要有外植体的基因型、亲本材料的年龄、生长环境，以及发育时期、取材季节、取材部位、天气现状等[21]。

外植体的基因型影响组培效果。张存旭[8]以4 株栓皮栎的未成熟合子胚作为外植体进行体胚诱导，研究发现母树基因型对体胚诱导率有显著影响。魏爽[11]在辽东栎母树基因型试验中也发现，不同母树基因型体胚发生频率差异较大。

不同的取材区域也存在不同的诱导成效。唐罗忠等[22]分析和对比了种胚、去皮种子、嫩枝、幼嫩茎、一年生木质枝条等的组培成效，结果表明，嫩枝和嫩茎有良好的成效，试验过程中污染少、组培苗成活率比较高、小苗生长和发育迅速。苏玛栎自然条件下萌发的枝条，无论是顶芽还是带腋芽的茎段，都存在非常严重的污染与褐变情况，没有通过离体培养获得再生植株[14]。Vengadesan等[18]将从体外生长8周龄的幼苗上切下的子叶节作为外植体，通过丛芽诱导，成功对北美红栎枝条进行了体外繁殖。通过对栓皮栎未成熟合子胚、叶片、茎段3种外植体的体胚诱导比较发现，未成熟合子胚的体胚诱导率累计57.8%，和茎以及叶片的诱导率有显著差异，茎的诱导成功率为25%，叶片的体胚诱导率为35%[4]。

能否成功进行组织培养的主要影响因素之一为取材阶段，具体取材时期因树种而异。成龄栓皮栎要想获得较好的组培效果，最佳采集外植体的阶段为3月上旬至4月上旬，在这期间采集外植体进行试验，萌芽率超过90%[23]。4—5月采集的大树嫩枝，污染率低、萌芽率高，为最适合采集大树嫩枝的阶段；采集幼苗茎段的阶段为4 月和6 月，只有13.1%、14.3%的污染率，实现了74.7%、72.1%的萌芽率[22]。8 月上旬为辽东栎体胚诱导的最佳采样时间，此时未成熟合子胚体胚诱导率最高，为88.7%，与其他时期相比，诱导产生的体胚生长健壮、整齐[11]。

2 培养基选择

研究表明，夏栎在WPM、BTM 培养基内，比在GD、MS 培养基中有更大的诱导率，且生长更好；MS 培养基的诱导率较低，为10%~25%，GD 培养基内，诱导的嫩芽较短时间就枯死[24]。谷栎丛芽诱导研究表明，基础培养基对外植体的芽诱导数有显著影响，BTM 和GD 培养基上诱出的芽总体上生长健壮，而在WPM 培养基上的芽通常萎黄[25]。李文文等[26]在基本培养基对蒙古栎腋芽启动和生长的影响试验中发现，1/2 MS 培养基比BTM 和MS 培养基更有利于腋芽的启动和生长，腋芽在BTM 和MS 培养基上启动时间长，芽生长情况差，不伸长，后期直接枯死；而在1/2 MS培养基中启动时间最早，有效芽数量最多，芽生长最为健壮，平均长约3.00 cm，最长5.20 cm；在WPM 培养基上生长状况一般。吕秀立等[14]以MS、1/2 MS、WPM 为基础培养基，发现试管苗在WPM培养基中比在MS、1/2 MS培养基上生长更好，在MS、1/2 MS 培养基的试管苗均生长较差，苗发黄茎细弱，生长一段时间后逐渐衰弱。由此可见培养基中某些元素的含量以及种类对栎属组培苗的生长有明显影响。

在同一树种不同诱导途径的试验中，同一基本培养基的诱导效果千差万别，因此不同诱导途径对基本培养基的选择也会不同。栓皮栎茎段的离体培养选用低盐培养基WPM、BTM、GD 比高盐培养基MS诱导产生的丛生芽多，茎粗壮[27]，胚轴伸长快，诱导率也较高[8]。于艳等[28]在研究麻栎的不定芽诱导时发现，选用1/4 MS（2倍铁盐）作为基本培养基时，诱导效果比MS、WPM培养基更好，诱导率达86.7%，且褐化率仅为5.0%。廖婧[29]利用麻栎成熟合子胚进行体胚诱导时发现，MS基本培养基的诱导效果好于WPM基本培养基。MS培养基的主要特点是无机盐和离子浓度高，含有微量元素种类多，可以促进体胚发生[30]。

同种材料处于初代培养、继代培养、生根培养等不同阶段时所用培养基也有所不同。研究认为低盐培养基更利于组培苗生根，因此在生根阶段所用培养基的大量元素含量可以在原来的基础上减半。在BMT 培养基中开展大叶栎继代培养，单芽生根试验在1/2 BMT培养基中开展和实施[31]。辽东栎诱导丛生芽以及增殖芽的最佳培养基为MS培养基，增殖系数高达4.3，生根培养环节应用了降低大量元素含量的1/2 MS 培养基，不定芽生根率最高达77.8%[11]。苏玛栎在1/2 MS基本培养基上初代培养，继代培养在WPM培养基上生长情况更好，试管外生根率高达80%[14]。北美红栎的子叶节在MS 培养基上的诱导率达到64.7%，而芽增殖和伸长在WPM 培养基上达到最佳，最高为73.3%[18]。蒙古栎促萌茎段的离体培养过程中，在WPM 培养基上初代培养比在MS 和1/2 MS培养基上效果更好，腋芽生长伸长明显，产生的丛生芽更多[12]。

3 植物生长调节剂对组织培养的影响

植物生长调节剂的使用视具体情况而定，相同或不同植物途径不同其应用的植物生长调节剂的浓度、种类等也有显著的差别。

在成龄栓皮栎的芽诱导中，6-BA是最利于芽诱导的细胞分裂素，过高浓度的6-BA促使植株形成愈伤组织，但会导致植株生长异常，0.2 mg/L的浓度最有利于成龄栓皮栎芽诱导[23]。体细胞胚胎发生过程中不同阶段需要添加不同的植物生长调节剂。张存旭[8]在栓皮栎体胚诱导研究中发现，在继代过程中，添加1.0 mg/L 6-BA 和0.25 mg/L NAA 更有利于体胚的增殖。赵丹[9]在诱导麻栎腋芽萌发时发现，当培养基中添加1.0 mg/L 6-BA 时，腋芽颜色深绿，长势较好；在进行芽增殖时，相同浓度处理水平下，使用生长素NAA 的增殖系数均比用IBA 的增殖系数大；而对于细胞分裂素，6-BA 增殖效果要好于KT，浓度为1.0 mg/L 时，丛生芽长势最好，6-BA 对麻栎幼苗茎段芽的增殖生长起决定性作用，1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA是幼苗茎段增殖的最佳组合。麻栎叶片诱导愈伤组织使用生长素2，4-D的效果要好于NAA，最佳浓度为1.5 mg/L。廖婧[29]将麻栎成熟合子胚作为外植体，在体胚诱导中，将1.0 mg/L 6-BA与1.0 mg/L IBA 组合，获得最佳诱导效果；将茎、叶作为外植体的体胚诱导中，又添加了0.1 mg/L TDZ。吕秀立等[15]利用苏玛栎的茎、叶作为外植体，在MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT 的组合中获得了较多的愈伤组织；而在增殖过程中，3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的培养效果最好。欧洲栓皮栎的叶片用于体胚诱导中，1.0 mg/L 2，4-D 与2.0 mg/L ZT 组合获得了较高的诱导率[17]。对于蒙古栎丛生芽的诱导，0.5 mg/L 2，4-D和6-BA一起使用诱导率达到76.7%，诱导效果最好；而在增殖阶段，0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA是最佳组合，增殖系数可达到3.5[12]。6-BA作为有效的细胞分裂素，具有良好的诱导芽形成的能力，因此在增殖培养过程中，提高其浓度，有利于形成较多数量的丛生芽。

除了6-BA、2，4-D、NAA、IBA 等常用的植物生长调节剂，在有些试验中也会加入GA3、ABA等。北美红栎以子叶节为外植体进行诱导时，WPM中添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L GA3的诱导效果好于MS添加6-BA和TDZ，芽诱导率高，诱导的丛芽数量多[18]。Purohit 等[32]也提出，虽然1.0 mg/L GA3可以协同6-BA进一步提高芽诱导数量与芽高度，但会使芽生长细弱。张存旭[8]在进行栓皮栎体胚的成熟培养时，在MS培养基中加入了ABA，体胚的成熟率提高了3倍以上，低浓度的ABA（0.5 mg/L）使成熟体胚子叶明显伸长变绿，偶有体胚会产生胚根。

4 生根培养

目前，生根培养是植物组织培养的一个难题。与作物相比，林木生根难度更大。因此，生根培养的难题是木本植物组织培养必须要重视的问题。

在生根培养中，适当降低培养基中矿质元素浓度，生长调节剂只添加生长素，提高蔗糖浓度是诱导生根最常用手段。魏爽[11]在辽东栎的生根培养中发现，在蔗糖浓度为30 g/L时，丛生芽在1/2 MS培养基中的生根情况比MS 更好，生根率提高了40%，平均根长为3.8 cm，且根系长势很好；蔗糖浓度主要影响根的粗度和长度，蔗糖浓度为20 g/L时，尽管有健硕的根系，但平均根长度只有2.5 cm，叶片发黄，苗情不好。张存旭等[27]表示应用NAA进行生根诱导中，伴随浓度的提高其生根率也表现出逐渐递增的发展态势，首先在IBA 浓度为0.5 g/L 的溶液内浸泡1 min，随后转入空白培养基，仅需很短的出根时间，根长而粗壮，大多有侧根，但生根率很低，并且在茎段区域有很大的愈伤块；在培养基内添加1.0 mg/L IBA 的处理，芽基部愈伤比前一处理小，生根率较高，苗生长正常，但形成的根数偏少。0.1 mg/L NAA+0.25 mg/L IBA 的组合最有利于栓皮栎生根，生根率高，根系质量好。丁世民等[13]得出诱导沈氏栎试管苗生根的最佳组合是1/2 MS+0.4 mg/L NAA，生根率最高为97.7%，每茎段平均生根2.93 条，1/2 MS 比MS 与1/4 MS 更适合沈氏栎生根，当NAA浓度超过0.4 mg/L 后，生根率和平均生根条数反而降低。在蒙古栎芽苗的生根培养中，1/4 MS 培养基添加20 g/L 蔗糖时，大部分芽苗枯黄、死亡，而添加30 g/L 蔗糖更有利于芽苗生长，能促进生根[26]。添加0.1 mg/L IBA＋0.5 mg/L NAA 的1/2 MS培养基为蒙古栎茎段的最佳生根培养基，生根率达到76.7%，每个单株的平均根数可以达到4.3 条，NAA 浓度超过0.5 mg/L 后生根率降低，表明较高的NAA 浓度会抑制生根[12]。于艳[28]在麻栎组培体系优化研究中发现，生根培养时NAA 处理后长出的根多为愈伤根，移栽不易成活，IBA比NAA更有利于麻栎小苗生根。Chalupa[20]研究发现，材料越幼嫩越利于生根，影响生根的因素中基因型的影响力大于基本培养基与植物生长调节剂，12 个不同无性系的生根率为14%~86%。

此外，生根还有一步生根法、两步生根法等。北美红栎的变种就用了两步生根法，先将1.5~2.0 cm的继代芽接入到含25 mg/L IBA 的1/2 WPM 培养基中培养48 h，之后转移到不含植物生长调节剂的1/2 WPM+4 g/L AC 培养基中，转接后不需要进行暗处理，多个变种的生根率达到70%~90%[19]。

5 存在的问题与解决方法

5.1 污染

栎属组织培养中存在污染问题，造成污染的原因有许多，对污染原因的研究多是关于材料取材时期、消毒时间、外植体类型等。杨锋利[23]从3—7 月每个月对栓皮栎母株取材，在早春3 月上旬采集的成龄茎段诱导的嫩枝做外植体诱导培养的效果最好，污染率只有6.6%，萌发率达96.7%，夏季7 月采集的茎段培养的外植体诱导效果最差，污染率达56.7%，萌发率仅为63.3%。这主要是因为3 月份外植体处于休眠后期，即生长停止，营养物质积累，即将进入萌发期，生理活性水平升高；同时此时气温低，雨水少，病菌等不易滋生，材料不易污染。消毒时间的选择也很重要，消毒时间短不能有效杀死病菌，消毒时间过长时，消毒更彻底，污染率较低，但同时对植株的毒害作用较严重。栓皮栎种子在0.1%升汞中消毒25 min，对胚的诱导效果最好；而胚根消毒4 min效果最好[23]。用麻栎的去皮种子、大树1年生木质化枝条和胚作为外植体，污染率分别为70%、75%、50%，且萌发情况不好，死亡率较高，而选用种子萌发的幼苗和麻栎大树嫩枝作为外植体，污染率分别为5.0%、23.8%，萌发率分别为50%、70.7%，试验效果较好[9]。

5.2 褐化

导致栎属植物培养材料褐变的因素很多，外植体的基因型不同、材料本身的生理性状不同都会影响外植体的褐化。防止褐变的主要措施有选择分生能力较强的材料作为外植体，在培养基中加入活性炭等抗褐化剂，在培养初期进行连续转移等。

在组织培养防止褐化的研究中，抗褐化剂主要有维生素C、硝酸银（AgNO3）等[33]。刘光金等[34]发现，在不添加AC与维生素C的培养基上大叶栎的褐化率高达80%，而在培养基中添加1.0~3.0 g/L AC或0.1~0.3 g/L 维生素C 之后褐化率降低至42.5%~58.3%。丁彤[35]研究表明，AgNO3、PVP、Na2S2O3、AC这4种抗褐化剂中，Na2S2O3抗褐化效果最好，在培养基中添加200 mg/L Na2S2O3的处理可将北美红栎的褐化/死亡率降低至20%。李文文等[26]在培养基中添加0.2 g/L PVP能有效抑制蒙古栎外植体褐化，褐化率和褐化程度都明显降低。另外，于艳等[36]研究认为，选用5 年生实生苗幼嫩茎段作为外植体，0.1%HgCl2溶液表面消毒7 min 后接入诱导培养基，在初代培养前期暗培养5~7 d，褐变死亡率可降至5%以下。

6 展望

栎属植物组织培养除了少数树种组培技术比较成熟之外，依旧有很多树种目前处于探索时期，获得成功的树种普遍是将幼嫩材料作为外植体，而老龄树则很难，关键的问题为：①诱导培养时，污染与褐化严重；②继代培养时，玻璃化及褐化现象普遍存在；③生根培养时，器官培养生根困难，体胚发生萌发阶段也会出现生根困难等问题。

木本组织培养研究目的主要是进行优良种质无性化推广。要打破木本植物组织培养技术的瓶颈，下一步研究关键包括以下几个方面：①优良单株的高效幼化技术。通过对成龄材料进行修剪、诱导根萌条，能够有效提高成龄材料的组织培养效果。②基本培养基矿质元素、有机物质等的优化调控，可提高增殖效果及芽的质量。目前的研究试验中使用的培养基多为WPM、BMT、MS等固定元素含量的基本培养基，部分研究中会将这些培养基的矿质元素含量降为1/2或1/4，受经验和技术水平的限制，大部分试验中都没有对其中元素进行调配。这也是今后的一个研究方向。③以成年优树为母本材料的体细胞胚胎发生技术。大树叶诱导体胚的成功，对于经遗传测定的优良基因型的扩繁具有重要意义；合子胚等幼年组织诱导率可达100%，而成年材料诱导率一般仅有20%[8]，因此，成年材料体细胞胚胎发生技术的优化提升也是未来研究的一个方向。

栎属植物的组织培养研究还有很大的发展空间，其技术研究有待进一步深入，褐变、玻璃化、生根等技术难题需要科研人员更多的努力，才能取得新的突破。随着栎属组织培养技术的成熟及其在栎属植物育种和遗传转化中的广泛应用，栎属植物的经济价值、生态价值和园林应用价值也将得到更大程度的发挥。