三叶青的生药学研究※

●李振斌 （黔西南民族职业技术学院 贵州 兴义 562400）

三叶青学名三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDielsetGilg），为葡萄科崖爬藤属植物，为民族民间常用中草药，主要分布于贵州、浙江、广西、福建等地，全草具有清热解毒、活血祛风等功效，可用于治疗流行性感冒、肝炎、泌尿系统结石等[1-3]，素有“植物抗生素”等美誉。随着其药用价值的不断开发，金奇片、金丝地甲胶囊等中成药问世，进一步促进三叶青产业发展。目前，以浙江、福建、湖南、广西产三叶青研究居多，对贵州产三叶青研究甚少，特别是黔喀斯特地区，因地形地貌独特，植物特征鲜明，缺乏该地区三叶青的基础研究，且尚存在产地把狭叶三叶青及其同属植物混作三叶青栽培，缺少质量评价研究，影响本品的合理使用。鉴于此，本试验开展三叶青生药学研究，以期为三叶青的准确应用和深入开发提供科学依据，为质量标准的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品自采，共9批，其中3批栽培，6批野生，详见表1。经贵州黔西南喀斯特区域发展研究院邓朝义研究员鉴定为三叶崖爬藤的全株。

表1 样品来源

槲皮素（对照品）购于中国食品药品检定研究院国家药品标准物质网，批号：100081-201610。

1.2 仪器

EX30生物显微镜（宁波舜宇仪器公司）；FA224分析天平（ 万分之一，上海舜宇恒平科学仪器）；KS-5200DB超声波清洗机（昆山洁力美超声仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 鉴别 对不同产地三叶青进行地理标记，以物候期为指向，定点观察其植物特征，记录植株特点；对收集的药材进行干燥，观察描述药材不同部位性状特点，并对其进行粉碎，通过制片显微镜观察药材的粉末显微特征。

1.3.2 薄层色谱 取干燥的三叶青全草粉末10 g，稀乙醇250 mL回流提取2 h，冷却过滤并蒸干，用适量水混悬，乙酸乙酯萃取3次，每次 100 mL，合并乙酸乙酯层，浓缩至约5 mL，得供试品溶液。取槲皮素对照品适量，加无水甲醇溶解，制得1 mg/mL对照品溶液。照中国药典薄层色谱法（通则0502）试验[4]，分别吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上。以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸（9∶4∶1）为展开剂，展开，取出晾干后喷以1%AlCl3乙醇溶液，于紫外灯（365 nm）下检视。

1.3.3 水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物测定 水分按照《中国药典》2020年版四部通则0832水分测定法（第二法 烘干法）[5]测定；总灰分、酸不溶性灰分按照《中国药典》2020年版四部通则2302灰分测定法测定。

浸出物测定按《中国药典》2020年版四部通则2201浸出物测定法，分别用60%乙醇、水作溶剂，以冷浸法、热浸法筛选确定理想的溶剂和提取方法。

1.4 数据处理及分析

涉及数据用SPSS 24.0与Excel2010软件统计数据，并进行组别的差异性分析。P＜0.05表示差异显著，每组试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 原植物鉴别

草质藤本。常分枝，匍匐或攀沿，具5纵棱，无毛或被疏柔毛。卷须不分枝，与叶对生。复叶有3小叶，小叶披针形、长椭圆披针形，长5～9 cm，宽1.7～3.5 cm，顶端渐尖，基部略楔形，侧生小叶基部不对称，边缘每侧有4～8个锯齿，上表面绿色，下表面略浅，无毛；侧脉5～6对，网脉不明显；叶柄长4～7 cm，中央小叶柄长0.5～1.8 cm，侧生小叶柄长0.2～0.4 cm，无毛或被疏柔毛。花序腋生，下部有节，节上有苞片，二级分枝集生成伞形，花二歧状着生在分枝末端；花序梗被短柔毛，长1～2.5 mm；花蕾卵圆形，萼碟形，萼齿细小，卵状三角形；花瓣4，卵圆形，无毛；雄蕊4，花药黄色；子房陷在花盘中，柱头4裂。果实近球形或倒卵球形（青色，橙红色，后为乌黑色），直径0.4～0.6 cm，有种子1颗。花期5～7月，果期8～11月。对比发现，栽培品与野生品原植物特征无明显区别。

2.2 性状鉴别

2.2.1 野生品 块根类圆球形、纺锤形或不规则块状，长1～7 cm，直径 0.5～4 cm；表面棕褐色或灰褐色，稍皱缩，具类网状纹理，偶见皮孔状凸起，残留棕褐色细根或根茎；质地硬而脆，断面略平坦，粉性，类白色或浅棕红色。茎五棱形，表面暗棕褐色或黄绿色；可见节，稍膨大；质脆，断面纤维性。叶皱缩，多破碎，完整叶片展平后为三出掌状复叶；上表面黄绿色或暗绿色，下表面色稍浅，无毛。气微，味微甜。

2.2.2 栽培品 块根椭圆形、纺锤形、长条形，长2～8 cm，直径0.6～3.5 cm，偶见类网状纹理，质地稍硬，断面略平坦，富粉性。茎特点与野生品无显著区别。叶片颜色较野生品偏黄，为黄绿色或黄褐色，完整叶片亦较野生品多。

2.3 显微鉴别

粉末灰棕色或灰褐色。淀粉粒椭圆形、类圆形或纺锤形等，多单粒，直径9～45 µm。网纹细胞较多，壁稍厚，黄棕色或黄色，直径121～189 µm。草酸钙针晶散在或成束存在于纺锤形黏液细胞内，长36～129 µm。草酸钙簇晶散在或排列成行，直径10～74 µm。可见角质层组织。螺纹导管多见，孔纹导管直径42～98 µm，纤维长梭形，壁厚，胞腔狭小。叶片下表皮细胞多角形，气孔为平轴式或不定式。栽培品与野生品粉末特征无明显区别。见图1。

图1 三叶青全草粉末显微特征图（10×40）

2.4 薄层色谱鉴别 从图谱可见，1～9号样品与对照品在相同位置均有斑点显示，但呈不同颜色斑点，说明各样品中可均含槲皮素，但还夹杂其他成分，该方法需要再次优化升级，方可达到有相同和清晰斑点呈现。见图2。

图2 三叶青药材薄层色谱图

2.5 水分、总灰分及酸不溶性灰分测定结果

2.5.1 水分 9批三叶青药材中水分含量范围为8.86%～11.15%。由表2可知，野生品因产地不同，水分含量变化较为明显，以贵阳产药材水分含量较高，安顺产药材含量较低，但各地栽培品药材水分含量变化差异不明显。

表2 三叶青药材水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定结果 单位：%

2.5.2 总灰分、酸不溶性灰分 9批三叶青药材中总灰分含量范围为6.91%～9.76%，野生品以六盘水和贵阳产药材较高，栽培品各产地药材无显著差异。酸不溶性灰分含量范围为0.75%～1.49%，野生品同一地区不同批次间存在显著差异，不同地区间亦存在显著差异；栽培品各产地药材变化较小，相对稳定。

2.6 浸出物测定

2.6.1 提取方法考察 通过对不同溶剂和不同提取方法进行试验发现，溶剂以60%乙醇提取效率较高，用冷浸法提取为宜（表3）。

表3 三叶青药材不同提取方法浸出物测定结果（n = 3）

2.6.2 样品浸出物含量 9批三叶青药材（全草）浸出物含量范围为12.17%～13.58%。各产地的样品浸出物含量差异不显著，同一产地不同批次间差异亦不显著，其中以栽培品浸出物含量相对较高（表4）。

表4 9批三叶青药材浸出物测定结果（n = 3）

3 讨论

本研究对黔喀斯特地区三叶青经过长期观察对比发现，其特征与《中国植物志》[6]和刘培刚等[7]等对三叶青原植物描述，形态特征基本一致，但叶片较之略宽长，花期稍有后移，且茎有较明显五纵棱纹。药材块根部稍大，表面网状纹较清晰；茎可见五纵棱，暗棕褐色或黄绿色，节稍大，断面纤维性，叶皱缩，多破碎，黄绿色或暗绿色，下表面色稍浅，《湖南省中药材标准（2009年版）》《浙江省中药材质量标准（2017年版）》（下称“湖标”“浙标”）中未见描述。栽培品较野生品偏长椭圆状，稍光滑，茎无显著区别，叶片颜色偏黄。在粉末特征方面，本研究对象为全草（含块根），淀粉粒、草酸钙针晶和簇晶与“浙标”和崔伟亮等[8]描述一致，但未对网纹细胞进行描述。此外，全草粉末中可见角质层组织，螺纹导管、孔纹导管，纤维束、平轴式或不定式气孔等。

参照李鹤[4]、崔伟亮等[8]薄层鉴别法，以稀乙醇为溶剂制备供试品和槲皮素作对照展开发现，三叶青全草在相同的位置出现相同斑点，但斑点颜色与对照不一致，经过增加萃取次数、活性炭吸附处理欲排除色素干扰，但斑点颜色并未呈现相同颜色，说明对于三叶青全草需要进一步探索合适的提取方法和展开系统，但样品与对照品在相同的位置有斑点出现，侧面印证了前者研究结果。

4 结论

喀斯特地区三叶青栽培品与野生品植物外观形态上区别较小，药材形态差异为块根偏长椭圆状，稍光滑，茎五棱状特征清晰，叶片颜色偏黄，破坏率相对较低；全草粉末中均可见角质层组织，螺纹导管、孔纹导管，纤维束、平轴式或不定式气孔等；水分、总灰分、酸不溶性灰分含量，因产地和环境差异而表现出不同程度的差异，但从数据分析，较野生品稳定，变化幅度小；栽培品浸出物含量较野生品高。综合分析，喀斯特地区三叶青驯化栽培品生物特性相对突出，标示性较强，水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量等生理指标较具优势，在三叶青资源开发及产业化发展中可作为有效路径进行探索，栽培替代野生品，亦可对野生三叶青资源进行保护。同时可补充黔产三叶青理论依据，为其质量标准的制定提供参考。