离子通道蛋白Piezo1在人源非小细胞肺癌中的功能研究

赵敏萱,夏凡晨,刘 晨,张文悦,石金磊,康宇佳

(上海科技大学 生命科学与技术学院,上海 201210)

0 引言

肺癌是全球发病率最高的癌症之一,2021年,世界卫生组织国际癌症研究机构发表的2020年全球癌症报告显示,肺癌患者新增220万例,仅次于乳腺癌,死亡病例数占据首位,远超其他癌症类型[1]。肺癌通常分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC),其中非小细胞肺癌可细分为肺腺癌、鳞状上皮细胞癌及大细胞癌。作为长期受到气压、气流及血流应力牵拉刺激的器官,肺组织的细胞中具有压力感受器,在细胞生理功能中起重要作用[2],这些感受机械力的结构可能与肺癌发病机制相关,并有机会成为肺癌精准治疗的突破口。

近年来,Piezo家族基因及其编码的机械力敏感型离子通道蛋白受到了广泛关注,Piezo家族蛋白能感受机械力,使阳离子通过,调节细胞的生理功能。Ca2+是细胞内重要的第二信使,影响多个信号通路,在细胞增殖、炎症因子分泌等多种生理过程中发挥了重要作用[3]。正常细胞通过调节离子泵与离子通道的开启及闭合,对胞内Ca2+浓度进行精确调控。Piezo1是一种Ca2+通道蛋白,在组织及器官中表达更为广泛[4],参与多种生理功能(如脉管及血液系统的发育调节、消化与泌尿系统的功能行使与调控、运动系统发育等),并作为关键分子调控肿瘤的生长、增殖、分化及迁移过程[5-9]。

对肺癌的研究表明,Piezo1表达量在小细胞肺癌与非小细胞肺癌中均下调,但对于A549细胞系中Piezo1病理机制的研究尚不明确。本研究以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,探究Piezo1蛋白表达变化对A549细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响,并研究其对细胞内Ca2+相关通路的作用,为Piezo1蛋白在非小细胞肺癌中的进一步研究提供理论基础,为肺癌治疗提供新的分子靶标。

1 实验方法

1.1 Piezo1敲减细胞系构建

所用细胞系为A549人源非小细胞肺癌细胞,用DMEM培养基培养,环境为37 ℃培养箱(5% CO2),siRNA采购自cohesion bioscience公司(货号:CRH6542)提供的4管siRNA,分别是实施高效敲减的si-A、si-B、si-C及si-scrambled(简记为si-NC),其与有效的siRNA有相同的序列组成,但是与mRNA没有明显的同源性,用于做转染的阴性对照。转染方式为脂质体转染法,所用试剂盒名称为Invitrogen®Lipofectamine 3000,操作步骤严格按照说明书进行,在96孔板中细胞汇合度达到70%～80%时实施转染,转染12 h后吸弃转染液并加入正常培养体系,在转染48 h后进行进一步实验。

1.2 qPCR

实验过程中用到两次qPCR验证基因转录水平,第一次用于验证siRNA敲减后Piezo1表达在转录水平的变化。从各组细胞中提取mRNA,再进行mRNA的逆转录[所用试剂盒为Takara公司的PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),货号:RR036A],取用500 ng mRNA逆转录产物的1/25进行qPCR试剂配置。实验结果均用QuantStudioTM进行分析。

两次用到的qPCR引物见表1。

表1 两次用到的qPCR引物

1.3 Western Blot

4 ℃预冷的PBS洗细胞,吸干后每个六孔板加入2.5 μL含PMSF的裂解液,冰上裂解30 min,4 ℃ 14 000 rpm离心10 min,取上清以BCA法进行蛋白定量,使样品浓度为1.5 μg/uL,95 ℃金属浴使蛋白变性。取40 μL蛋白溶液为上样量,10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(140 V)1 h,在250 mA电流下转膜2 h至聚偏二氯乙烯膜上,用5%脱脂奶粉/TBST室温封闭1 h,向各组中分别为加入一抗,除兔抗人Piezo1外均用Western一抗稀释液(公司:Beyotime,货号:P0023A)稀释,一抗分别为兔抗人Piezo1(1∶2000,5%脱脂奶粉/TBST稀释,公司:Beyotime,货号:AF7743)、兔抗人pAkt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:4060)、兔抗人Akt(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:4691 )、兔抗人p4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:2855)、兔抗人4EBP1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:9644)、兔抗人pS6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:9234)、兔抗人S6K1(1∶2000,公司:Cell Signaling Technology,货号:2708)及兔抗人GAPDH(1∶2000,公司:BBI,货号:D110016-0025)单克隆抗体,4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次5 min。加入二抗山羊抗兔 I gG抗体(目的蛋白1∶6000,内参蛋白1∶10 000,公司:BBI,货号:D110058-0025),室温孵育1 h。ECL显影液[Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Stable Peroxide Solution(TH271011)和Thermo Scientific SuperSignal West Pico PLUS Luminol/Enhancer Solution(TH270329)按体积比1∶1配置]显色3 min后显影。

1.4 细胞增殖水平验证

CCK8法用于验证细胞增殖水平,所用试剂为MedChemExpress公司购买的(货号:HY-K0301)。实验在96孔板中进行,具体操作方法参照说明书进行。

1.5 对于Piezo1蛋白通道的激活抑制验证

所用到的Yoda1试剂储存在-80 ℃中,在实验当天从冰冻状态取出,按照浓度梯度在室温中稀释,由于DMSO有细胞毒性,需要用DMSO调整,使最终梯度试剂中的DMSO含量为0.5%,令实验条件一致。GsMTx4溶解于PBS后于-20 ℃储存,使用当天从冰箱取出,配置浓度梯度。细胞预先铺在96孔板中,在各孔中加入400 μL药液及600 μL培养基后,在原细胞培养条件下继续培养24 h。随后吸弃原培养基,用排枪加入CCK-8试剂用于细胞增殖情况检测,在敲减回补实验中进行细胞转染,转染12 h后吸弃转染体系,恢复到正常细胞培养体系,转染48 h后加入药液培养体系,放入细胞培养箱孵育24 h后吸弃药液并进行下一步实验处理。

1.6 划痕实验

取用一个新的6孔板,孔背面在水平方向上用粗头马克笔均匀画三条横线作为基准线,约每隔0.5～1 cm横穿过孔。在6孔板中转染细胞,转染48 h后,待细胞汇合度达到95%以上,用移液枪取用200 μL枪头(Parafilm包裹固定),枪头竖直。稍用力抵靠孔底部,在中央基准线的1/3、2/3宽度处垂直于基准线慢慢在细胞层上划两条痕迹,过程中尽量保证力度一致。所有划痕操作使用同一只枪头完成,沿孔壁轻轻加入1 mL无菌dPBS洗涤2～3次,尽可能洗净悬浮细胞及细胞碎片,避免冲散划痕周围细胞。更换2 mL无血清或低血清培养基,将培养皿放回37 ℃、5% CO2培养箱中培养,每隔2 h取出培养皿进行拍照。拍照时曝光时间需要保持一致,用ImageJ软件处理图像。

1.7 Transwell小室侵袭实验

用不含血清的培养液稀释Matrigel基质胶,按照每孔40 μL量将细胞接种于24孔板对应的小室上室,37 ℃孵育3 h后在超净台中干燥12 h。将转染48 h的细胞用PBS清洗两遍后消化、收集,用含10% FBS的培养基洗细胞、离心、弃上清液、收集细胞,再用含10% FBS的培养基调整细胞密度至5×105个/ mL。取150 μL细胞置于小室上室,在小室下室加入800 μL含10% FBS的培养基,缓慢将上室浸入下室,避免产生气泡。培养48 h后,PBS清洗小室上表面,用PBS润湿的棉签小心擦去小室微孔膜上层的细胞,在干净的24板小孔中加入600 μL 4% 多聚甲醛固定液(PFA),浸没小室上下表面,固定45 min,0.1%结晶紫染20 min,置于显微镜下观察、拍照,用ImageJ软件处理图像。

1.8 Ca2+成像

所用试剂为Fluo-4 AM荧光探针(购买自Beyotime公司,产品编号S1060),进入细胞膜后,Fluo-4AM被细胞内酯酶切割成Fluo-4游离体,游离体与Ca2+结合之后能够发出较强荧光,用于细胞内Ca2+浓度的定量分析检测。实验使用6孔板,将培养状态良好的A549细胞转移到每孔含有3个平行细胞爬片的6孔板中,使用含有10%FBS与1%双抗的DMEM培养基,培养至细胞汇合度为70%～90%,随后进行正常转染操作。转染48 h之后,吸弃正常培养基,用PBS洗涤两次后暂时用PBS保护细胞不处于干燥状态,在暗处用2 mM浓度的Fluo-4AM母液配置含有2.5 μM探针的工作液共3 mL,吸弃用于清洗的PBS后,每孔加入500 μL工作液,以没过细胞爬片。随后用铝箔包裹6孔板,使其处于避光条件下,在37 ℃培养箱中孵育45 min。孵育结束后,吸弃工作用1 mL含1%FBS的PBS没过细胞表面,置于37 ℃培养箱中再次避光孵育30 min。随后吸弃孔内液体,将每孔爬片再次用1 mL PBS清洗一遍,在载玻片上滴加抗淬灭水性封片剂7 μL,将爬片细胞面扣在封片剂内制片,吸去多余封片剂及液体之后置于荧光显微镜下观察。图像在ImageJ软件中分析处理。

2 实验结果

2.1 Piezo1敲减细胞系中Piezo1表达下调

RT-PCR检测Piezo1敲减细胞系中Piezo1的mRNA表达水平,结果显示,si-Piezo1导致mRNA的表达量明显下调(图1a),差异有统计学意义(P<0.0001)。WB鉴定Piezo1敲减细胞系中Piezo1蛋白表达量,结果显示,在3个敲减细胞系中,Piezo1蛋白表达量均显著下调,其中si-B组Piezo1蛋白表达水平下调最为明显(图1 b、图1 c),表明siRNA沉默Piezo1基因表达的方法能在转录与翻译水平上同时抑制Piezo1的蛋白表达。

(a)RT-PCR检测对照组Piezo1基因转录水平 (b)WB检测对照组和敲减组中Piezo1蛋白的表达情况 (c)对照组和敲减组细胞中Piezo1蛋白相对表达量

2.2 Piezo1敲减造成非小细胞肺癌A549细胞增殖能力下调

2.2.1Piezo1表达水平下降造成细胞增殖能力减弱

CCK8法检测野生型A549细胞系与敲减细胞系细胞增殖能力,结果显示,与对照组相比,敲减组细胞增殖能力出现显著下调(图2a),差异有统计学意义(P<0.01)。Piezo1通道蛋白抑制剂GsMTx4[14]处理A549细胞,结果显示,细胞增殖能力与抑制剂浓度负相关,4 μM浓度处理的A549细胞增殖率降低程度最大,对Piezo1离子通道的抑制效果最强(图2b)。

(a)CCK8表征siRNA敲减前后细胞增殖情况,利用单因素方差分析,显著度分别为:si-A:P<0.0001,si-B:P<0.0001,si-C: P<0.01 (b)不同浓度抑制剂GsMTx4处理细胞后的增殖能力变化情况 (c～f)激活剂和抑制剂处理Piezo1敲减A549细胞后克隆形成情况变化,c,e为分别用不同浓度抑制剂GsMTx4和激活剂Yoda1处理后细胞克隆形成情况变化,d、f为对应数据统计结果。

2.2.2Piezo1蛋白活性降低抑制A549细胞的克隆形成

利用克隆形成模拟A549细胞在体内的增殖生长环境实验,结果显示,GsMTx4抑制组出现明显差异,克隆形成率与抑制剂浓度成负相关(图2c、图2d),表明Piezo1通道活性下降对克隆形成起抑制作用。Yoda1激活组中各浓度未出现明显的克隆形成率差异(图2e、图2f),暗示了在A549细胞系中,Piezo1的本底表达可能处于高水平。

2.3 Piezo1敲减造成非小细胞肺癌A549细胞迁移能力下调

细胞划痕愈合实验48 h结果显示,与对照组Si-NC及WT相比,Piezo1基因敲减组Si-A与Si-C的迁移细胞数明显减少,迁移率明显降低(图3a、图3b),差异具有统计学意义(P<0.01)。结果表明,Piezo1敲减对非小细胞肺癌A549细胞迁移能力具有明显的抑制作用。

(a)划痕实验48 h前后对比图像 (b)各组划痕修复的区域面积统计 (c)Transwell检测A549细胞侵袭 (d)利用孔内平均荧光强度计算得Fluo-4AM处理后A549细胞总体荧光强度 (e)Fluo-4AM处理后的A549细胞荧光图像 (f)利用单细胞荧光强度计算得Fluo-4AM处理后A549细胞总体荧光强度

2.4 Piezo1敲减造成非小细胞肺癌A549细胞侵袭能力下调

Transwell小室侵袭实验12 h结果显示,与对照组相比,Piezo1敲减组的侵袭细胞数明显减少(图3c),差异有统计学意义(P<0.0001)。结果表明,Piezo1敲减对非小细胞肺癌A549细胞侵袭能力有明显的抑制作用。

2.5 Piezo1敲减造成非小细胞肺癌A549细胞胞内Ca2+浓度下降

Fluo-4 AM Ca2+探针对Ca2+成像(图3e),结果显示,敲减组单细胞内部及细胞系总体的胞内Ca2+含量均减少(图3d、图3f)。

2.6 非小细胞肺癌A549细胞Piezo1敲减影响下游信号

2.6.1 非小细胞肺癌A549细胞Piezo1敲减后影响Ca2+通道下游磷酸化水平

Piezo1本身作为压力敏感型Ca2+通道,可能通过将机械应力信号转化为胞内Ca2+浓度信号,触发下游相关的信号通路,调控细胞的增殖及迁移表型。研究认为,Ca2+水平上升可能调控Akt磷酸化并启动下游通路[15],在经典通路中,Akt磷酸化抑制tuberin,解除TCS2对Rheb的抑制调控[16-17],使mTOR通路被激活并进一步磷酸化下游的4EBP1和S6K1[18],其磷酸化同步表征mTORC1的磷酸化水平。4EBP1磷酸化导致elF4E转录因子活化,从而激活基因转录及细胞增殖与迁移。WB结果显示,在Piezo1敲减细胞系中,pAkt的磷酸化水平被下调(图4a),4EBP1蛋白的磷酸化水平显著提高(图4b),而S6K1蛋白的磷酸化水平则没有发生显著的改变(图4c)。

2.6.2 非小细胞肺癌A549细胞Piezo1敲减后影响增殖、迁移及侵袭下游信号

由于转录因子的活化,选择下游部分基因,通过RT-PCR鉴定mRNA表达量,结果显示,敲减细胞系中,与增殖相关的Myc[19-20]、Cyclin-D1[21]、Cyclin-E[22]、CDK2转录水平均有明显下调(图4d),与迁移、侵袭表型相关的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin[23]等基因转录水平出现明显上调(图4e),其中si-B的效果较明显,表明Piezo1蛋白通过影响与增殖及迁移相关基因的表达,最终影响肺癌细胞的发生发展。

3 讨论

Piezo1是由一个长达2547个氨基酸构成的三聚体,呈螺旋桨式结构,各亚基通过36个跨膜域及2个跨膜域组成的离子通道锚定在细胞膜上[24]。研究认为,Piezo1蛋白结构构象契合杠杆作用原理,可能通过体外周跨膜螺旋单位(THU)作为机械力感受器,通过杠杆完成力的传递。研究发现,Piezo1不仅可以感受外界机械应力,还可以感知内源机械应力[25],从而认为Piezo1不只在膜上作为压感型离子通道,也在胞内通过细胞内蛋白复合体响应蛋白内应力并参与细胞内功能行使,这意味着Piezo1在细胞内信号通路中仍有尚未解析的功能。

本实验探究了Piezo1蛋白表达量与细胞增殖、迁移及侵袭能力之间的关系。实验结果表明,通过siRNA敲减Piezo1降低Piezo1蛋白的表达,可以显著降低A549细胞系的增殖、迁移及侵袭能力。在使用Piezo1蛋白抑制剂GsMTx4处理A549细胞系后得到了与siRNA敲减相似的实验结果。需要指出的是,GsMTx4是一种广谱性用于抑制压力敏感型离子通道的抑制剂[26],并不是Piezo1的特异型抑制剂,因此不能直接说明细胞的功能缺失完全是由Piezo1受到抑制而导致的。

在敲减细胞系中加入Piezo1蛋白的特异型激活剂Yoda1发现,该激活剂可以部分恢复癌细胞的增殖能力,这从另一个角度证实了A549细胞系增殖能力的下降确实是由于Piezo1蛋白表达量降低所引起的。然而,用Yoda1处理野生型A549细胞发现,其对细胞增殖能力的改变并不明显,这表明在A549细胞系中Piezo1的本底表达与通道活性相对较高。划痕实验与Transwell小室侵袭实验进一步证实Piezo1敲减造成A549细胞迁移及侵袭能力下降。

研究认为,作为机械力敏感的阳离子通道蛋白,Piezo1可能通过影响细胞内的Ca2+浓度调控细胞表型。胞内Ca2+探针实验结果表明,Piezo1敲减细胞Ca2+浓度下降明显。有文献指出,Piezo1敲减的人源骨髓巨噬细胞中,PI3K/Akt途径受到抑制,其中Akt磷酸化水平降低而PI3K表达没有受到影响,暗示Piezo1采用一种PI3K之外的Akt激活途径[27],由此猜测在非小细胞肺癌中,Ca2+变化可能通过某种方式影响Akt磷酸化水平,因而尝试验证在A549中Piezo1与Akt激活的关系。结果表明,敲减Piezo1降低Piezo1蛋白的表达能够导致A549细胞中Akt磷酸化水平的降低,与之前的研究结果一致。

由于Akt通路下游的mTORC1通路与细胞增殖相关,进一步验证了Piezo1影响细胞增殖、迁移及侵袭的下游分子机制十分必要。在基因转录水平上探究增殖相关的Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2与迁移相关的E-cadherin、N-cadherin及Vimentin的表达情况。RT-PCR结果表明,Myc、Cyclin-D1、Cyclin-E、CDK2转录水平明显下调,与前期细胞增殖表型的下调相一致,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin转录水平则明显上调。在细胞上皮间充质转化(EMT)过程中,迁移相关的三个靶标发挥着重要的作用。E-cadherin作为本地黏附分子在EMT过程中表达量降低,而N-cadherin与Vimentin表达量增加,增强细胞的移动能力以完成EMT过程[24]。在EMT过程中,细胞需要解除自身与周围介质的黏附才能开启一系列的迁移模式,因此作为EMT过程的开端,E-cadherin的表达下调非常重要。在转录水平上,E-cadherin的上调可能比N-cadherin及Vimentin的作用更为突出,从而导致宏观上A549细胞的迁移能力减弱。

近年来,人们一直在研究Piezo1与疾病之间的关系。不同类型的癌症中,Piezo1的作用不尽相同。在骨肉瘤中,Piezo1激活后促进细胞凋亡,而敲减Piezo1则会影响肿瘤形成能力并挽救细胞凋亡[28]。在肝细胞癌(HCC)中,Piezo1表达显著上调,敲低Piezo1会导致细胞增殖、迁移、克隆形成及体内肿瘤形成等方面的显著损伤[29]。在MCF-7乳腺癌细胞中阻断Piezo1通道的功能会减弱细胞的迁移能力[30]。在结肠癌中Piezo1表达量的上调,过度表达Piezo1可促进结肠癌细胞的迁移及侵袭[31-32]。在胃癌细胞中敲低Piezo1可减弱细胞的迁移能力[33]。

本研究对Piezo1下游信号通路的实验验证了敲低Piezo1会影响Akt的磷酸化进程,并进一步影响增殖相关蛋白的转录活动,从而导致A549细胞增殖表型受到抑制。目前已经研究过的Piezo1相关下游通路包括激活ORAI1通路并引发淋巴管萌芽[34],在肺动脉中激活Akt与eNOS[35],在卵巢癌中激活Hippo/YAP通路[36],在HCC组织中通过招募Rab5c来激活TGF-β通路[29]，在H1-L细胞系中激活CaM/Src/Pitx2通路[37],在神经干细胞中激活BMP2/Smad通路并调控干细胞发育[38]等。Piezo1的具体下游通路仍需进一步验证。