18 种植物提取物对松木蓝变菌可可球二孢的抑制性研究

黎秋红，唐洁兰

（广西苍梧县国有天洪岭林场，广西 苍梧 543100）

木材蓝变又称青变，蓝变是松木在开发利用过程中常见的问题，蓝变最初发生在锯材的表面和原木的端面，渗透到木材内部导致木材易腐朽，严重影响木材外观，大大降低使用价值[1-3]。球壳孢科的可可球二孢（Lasiodiplodia theobromae）是引起木材蓝变的主要病原菌[4]。它广泛分布于热带、亚热带和温带。其寄主植物已知约500 种，广西松木的蓝变主要由可可球二孢引起，被蓝变菌污染的木材变为灰蓝色或灰黑色，菌丝通过木射线进入木材内部组织的树脂道和木射线内，并可穿过纹孔蔓延扩散，原木砍伐后陆地存放1 个月，两端头蓝变深度可达30 cm[5-6]。目前防治木材蓝变的技术主要依赖于五氯酚钠和铬砷酸铜等化学药剂的处理[7]。但对哺乳动物毒性大并含有微量剧毒物质二恶英，因此日本和欧洲许多国家已经完全禁止使用五氯酚同系物及其钠盐[8-9]。随着科技的进步，一些生物防治方法也逐渐得到应用，例如通过微生物间的竞争、抗生和利用关系，对木制品进行长期保护时，有益菌发挥“积极”竞争能力，抑制有害真菌、细菌、放线菌等微生物生长，去除蓝变菌[10-12]。但上述生物杀菌剂的共同缺点是原料来源少、提取成本高、得率低。因此开发高得率、成本低、原料易得且广泛的植物源防蓝变药剂成为当务之急。该试验采用18 种植物的粗提物对可可球二孢的离体进行活性研究，以期找到具有较高抑制活性的植物，为开发新型无污染抗松木蓝变天然植物源杀菌剂提供基础试验数据。

1 研究方法

1.1 试验地概况

植物样品采集地广西梧州（110°18′～111°40′ E，22°37′～24°18′ N），属亚热带季风气候区，处于海洋性气候与大陆性气候的过渡地域。夏半年盛行暖湿的海洋气团，冬季盛行干冷的大陆气团。地处低纬度地带，太阳辐射强，夏长冬短，无霜期长，年均331 d。年均气温21.2℃，1 月气温最低，平均气温为7.3℃，7 月最高平均气温34.4℃，年均降雨量1 506.9 mm。≥0℃总积温为7 738℃，≥10℃的活动积温为6 925.3℃，年平均相对湿度79%，春夏潮湿、秋冬干燥。年平均日照时数1 725.4 h。土壤为砂页岩赤红壤，土壤平均厚度80 cm 以上。林下灌木常见植物主要有桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）、野牡丹（Melastoma candidum）、渐尖毛蕨（Cyclosorus acuminata）等。

1.2 试验材料及方法

在选取分布广泛、常见且具有一定抑菌表现的植物18种，分别是：黄荆（Vitex negundo）、柚子（Citrus grandis）、黄花夹竹桃（Thevetia peruviana）、红花夹竹桃（Nerium indicum）、马尾松（Pinus massoniana）、苦丁茶（Ilex kudingcha）、开口箭（Tupistra chinensis）、苦麻（Sonchus brachyotus）、排风藤（Solanum lyratum）、飞龙掌血（Toddalia asiatica）、羊耳菊（Inula cappa）、排钱草（Phyllodium pulchellum）、湖北海棠（Malus hupehensis）、枇杷（Eribotrya japonica）、下田菊（Adenostemma lavenia）、阴香（Cinnamomum burmannii）、苦楝（Melia azedarach）、桑黄（Phellinus igniarius）。采集植物的枝叶果皮、茎块等材料用于进一步抽提试验。

1.2.1 植物提取与培养基制作。将采集的植物材料晾干置于烘箱，在80℃下连续烘干48 h。取出粉碎，取50 g 加入500 mL 的三角瓶中，加入400 mL 无水酒精，在65℃的水浴锅中连续蒸馏提取12 h，过滤回收残渣，再次倒入400 mL 酒精提取12 h 后将滤液汇集。在旋转蒸发仪上将滤液浓缩得到初提液，在60℃烘箱中烘干得到初提物浸膏，置于4℃冰箱保存备用。培养基的制作参照防霉剂国标法进行[13]。

1.2.2 菌种来源与培养。可可球二孢菌种由广西大学林学院提供。在蓝变的马尾松原木上采集菌落，在马铃薯培养基上生长繁殖。通过DNA 测序筛选出可可球二孢霉菌并将菌种进行活化，保存于4℃冰箱中。

1.2.3 接菌与培养。称量一定量的提取物浸膏，溶于酒精后与已灭菌的培养基混合，制成相应浓度的含药培养基，冷却12 h 之后接菌。接菌时，在菌种培养皿上用直径0.5 cm 的打孔器取菌落边缘的霉菌，接至含药培养皿的中心部分。已接菌的培养皿倒置后装袋，放入28℃恒温培养箱中连续培养48 h。

1.2.4 粗筛选。参照生长速率法[14]，量取0.5 g 植物材料浸膏，溶于1 mL 的酒精中，制成0.5 g/mL 的药液。用移液枪吸取0.2 mL 到装有9.8 mL 已融化PDA 培养基（温度约60℃）的三角瓶中，再倒入培养皿中制成浓度为1 g/L 的培养基平板，平板凝固冷却后用打孔器接进大小、生长一致的病原真菌菌饼（直径为0.5 cm），每个培养皿接1 个菌饼，生长有菌落的一面朝下，每处理3 次重复，每次试验设置相同浓度的空白对照，以1 g/L 浓度的五氯酚钠作为阳性对照。

1.3 统计分析方法

因植物提取物的作用与真菌菌落直径大小呈相关性，因此学者们统计植物提取物的抑菌效果，多以菌落直径大小来对应比较的标准，以研究植物提取物对木材蓝变菌的抑制效果[13，15-17]。

接种好的培养皿倒置装袋，放入28℃的恒温培养箱内连续培养48 h 后取出，用十字交叉法测菌落的直径，抑制率计算公式如下：

2 结果与分析

入选植物提取物的材料以病原真菌菌饼直径的5～20倍为有效抑菌统计个数，对每种植物提取物材料取相同的质量进行抑菌筛选试验。从表1 可知，18 种植物入选的份数不同，其中开口箭、羊耳菊、湖北海棠（银皮苷）3 种的份数最少，只有4 份，阴香入选的份数最多，有7 份材料。另外，从入选材料菌落直径与抑菌率关系看，两者在数值上未表现出正比关系。18 种植物选取的材料平均直径也存在差别，变幅在3.74～8.50 cm 之间，粗筛选的材料平均直径为4.82 cm，入选植物材料的平均直径分为3 组，低于4 cm的是马尾松和黄荆，平均直径在4.00～6.00 cm 之间的共有16 份材料，而高于8.00 cm 直径的仅有湖北海棠（总黄酮）。

由试验结果可知（表1），不同的植物提取物对可可球二孢具有不同的抑制性。在1 g/L 浓度下，飞龙掌血对可可球二孢的抑菌率达到了最高的31.11%，抑制率达到20%以上的植物有马尾松、阴香、湖北海棠（银皮苷）、羊耳菊、黄荆。其中比较引人注目的是马尾松针的粗提物，松木常常容易发生蓝变，但是其松针却表现出了一定的抑制活性，在1 g/L 的浓度下抑制率达到了27.64%。另外湖北海棠（总黄酮）、排风藤、苦楝的粗提物发生异常，不仅没有抑制率，反而促进可可球二孢的生长，特别是湖北海棠（总黄酮），其抑制率达到了-52.38%，对可可球二孢的生长具有较大的促进作用。除了上述的植物种类之外，其他植物对可可球二孢具有一定的抑制效果，但是相对不明显，只维持在20%以下，因而在下一步进行梯度试验时将不采用这些植物。

用于阳性对照的五氯酚钠表现出了较强的抑制效果，达到了100%，说明在相同条件下较纯的化学药剂由于组分单一，抑制成分的含量较大，因而其抑制率相对明显；而粗提物由于组分混杂，具有抑制性的成分不明晰且含量较少，因此只有在较大的浓度下才能达到理想的抑制效果。

3 结论与讨论

对18 种植物19 类粗提物进行了对可可球二孢的抑菌性试验，从中选出抑制性强且资源丰富的植物作为防治松木蓝变的植物源杀菌剂的原料。18 种入选材料的平均菌落直径为4.82 cm，变幅为3.74～8.50 cm，存在显著差别。18 种植物提取物的抑菌率存在显著差别，平均抑菌率为11.64%，有15 种植物提取物的抑菌率为正值，有3 种植物提取物抑菌率为负值，分别是苦楝、排风藤（石油醚部分）、湖北海棠（总黄酮），其中湖北海棠（总黄酮）的抑菌率最差，负值高达52.38%。有6 种植物提取物的抑菌率高于20%，分别是飞龙掌血、马尾松、阴香、湖北海棠（银皮苷）、羊耳菊、黄荆。其中飞龙掌血的抑菌率最高，达到31.11%。我国植物资源丰富，对植物的药用也有悠久的历史，植物源抑菌剂具有广阔的发展前景。近年来国内对植物源抑菌剂的研究有了长足的发展[19]。植物源抑菌剂有污染少，对环境友好的特点，具有广阔的应用空间。经过试验发现，阴香、马尾松、飞龙掌血、羊耳菊、湖北海棠和黄荆对引起蓝变的主要菌种可可球二孢有较好的抑制性，再加上它们本身具有的优势，可以作为新的药物代替部分化学药剂或者与化学药剂混合使用，为防治木材蓝变提供新的途径，这几种植物在抑制木材蓝变方面具有显著的优势和开发空间。