2型糖尿病肾病大鼠白细胞介素-6、白细胞介素-10、转化生长因子-β1、组蛋白去乙酰化酶4表达及其与血糖、尿蛋白-肌酐比值的相关性

马东红，师晶晶，刘 云，侯玉龙，曹子彧，黎 妞，郭明好

(新乡医学院第一附属医院肾内科,河南 卫辉 453100)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)发病率逐年升高,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是T2DM常见的并发症之一,早期主要临床表现为尿蛋白-肌酐比值(urinary protein-creatinine ratio,UACR)升高。在DN发病过程中,肾脏局部炎症反应发挥了重要的作用[1]。白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种关键的促炎因子,IL-6与DN患者肾组织系膜增生和间质损伤程度有关[2]。白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是由调节性T细胞等多种细胞分泌的具有抗炎和免疫调节作用的因子。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)为参与细胞外基质沉积、成纤维细胞活化的重要因子,与DN的进展密切相关[3-4]。有研究发现,组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)介导的组蛋白乙酰化修饰在DN发生发展过程中发挥重要作用,使用HDACs抑制剂可延缓或逆转DN的进程[5],其中,HDAC4在DN发病过程中可抑制足细胞自噬并加剧炎症反应[6]。目前,关于DN发生发展过程中IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4表达水平变化及其与临床指标相关性的研究较少。基于此,本研究旨在探讨DN大鼠IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4表达变化及其与血糖、UACR的相关性,以期为2型DN的治疗提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

64只健康雄性Sprague Dawley大鼠购自山西医科大学生物实验中心,体质量 180～200 g,7～8周龄。

1.2 主要试剂与仪器

高脂高糖饲料购自北京博泰宏达生物有限公司,链脲佐菌素购自美国Sigma公司,放射免疫沉淀裂解液购自福州飞净生物科技有限公司,十二烷基硫酸钠、聚偏二氟乙烯膜购自北京索莱宝有限公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒购自新赛美生物技术有限公司,脱脂牛奶购自上海碧云天生物技术有限公司,兔多克隆IL-10抗体、鼠单克隆IL-6抗体、兔单克隆TGF-β1抗体、兔多克隆HDAC4 抗体均购自英国Abcam公司,电化学发光试剂购自广州捷倍斯科技有限公司,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G二抗购自北京博奥森生物技术有限公司,大鼠IL-10 酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、大鼠TGF-β1ELISA试剂盒均购自武汉华美生物工程有限公司,大鼠HDAC4 ELISA试剂盒购自上海扶生实业有限公司;全波长扫描酶标仪、恒温水浴槽、低温超速离心机购自美国 Thermo 公司,精密电子天平购自德国 Sartorius公司,移液器购自德国 Eppendorf公司,贝克曼AU5800全自动生物化学分析仪购自美国贝克曼库尔特有限公司,电泳槽、电转移装置购自上海天能科技有限公司,AlfaEaseFC 成像分析系统购自美国Alfa Innotech Corporation公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及各组干预措施

采用随机数字表法将64只大鼠分为对照组(n=32)和DN组(n=32)。DN组大鼠给予高脂高糖饲料6周后,经腹腔注射链脲佐菌素40 mg·kg-1,72 h后,取尾静脉血测血糖,血糖≥16.7 mmol·L-1表示T2DM模型大鼠制备成功,血糖<16.7 mmol·L-1的大鼠以30 mg·kg-1的剂量再次经腹腔注射链脲佐菌素;T2DM模型大鼠制备成功后,继续给予高脂高糖饲料喂养4周后,收集尿液,应用全自动生物化学分析仪检测大鼠尿微量白蛋白、肌酐水平,并计算UACR,UACR(mg·g-1)=尿微量白蛋白(mg·L-1)/尿肌酐(μmol·L-1)×8 840 ,UACR≥30 mg·g-1表示DN模型大鼠制备成功,DN模型大鼠造模成功后正常饮食饮水。对照组大鼠正常饮食饮水,经腹腔注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.3.2 大鼠体质量、血糖、UACR及肾脏指数(kidney index,KI)检测

于造模后第 0、4、8、12 周分批处死2组大鼠,每次每组分别处死8只。于每次处死前称大鼠体质量;使用罗氏血糖仪及配套试纸检测大鼠血糖;收集尿液,应用全自动生物化学分析仪检测大鼠尿微量白蛋白、尿肌酐水平,并计算UACR。大鼠处死后立即取出双侧肾脏,其中一侧肾脏去除包膜后称肾质量,并计算KI,KI=肾质量(mg)/体质量(g)。

1.3.3 Western blot法检测大鼠肾组织中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4蛋白表达

2组大鼠于不同时间点分批处死后,取出一侧肾组织,使用放射免疫沉淀裂解液裂解,研磨匀浆,使用低温高速离心机4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min,取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度。每孔取 20 μg 蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上,脱脂牛奶室温封闭l h,滴加IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4、 β-actin一抗,4 ℃孵育过夜。使用含吐温-20的Tris缓冲液洗膜10 min×3次,加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h,采用含吐温-20的Tris缓冲液洗膜 10 min×5次。采用电化学发光法显色,应用AlfaEase FC成像分析系统成像,应用Image J软件分析各条带灰度值,以β-actin为内参,以目的蛋白灰度值与β-actin的灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.3.4 ELISA法检测大鼠血清中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4水平

2组大鼠于不同时间点分批处死后,立即抽取;心脏血5 mL,置于抗凝管中,离心取上清,-80 ℃保存;采用ELISA法检测血清中IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4水平,严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 2组大鼠血糖、体质量、UACR和KI比较

造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠血糖水平和UACR均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后第 0周,2组大鼠的体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第 4、8、12 周,DN组大鼠的体质量均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后第 0、4周,2组大鼠的KI比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第 8、12周,DN组大鼠的KI显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 2组大鼠血糖、体质量、UACR和KI比较Tab.1 Comparison of blood glucose,body weight,UACR and KI of rats between the two groups

2.2 2组大鼠血清中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4水平比较

造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠血清中IL-6、HDAC4和TGF-β1水平均显著高于对照组,IL-10水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组大鼠血清IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4水平比较Tab.2 Comparison of serum IL-10,IL-6,TGF- β1 and HDAC4 levels of rats between the two groups

2.3 2组大鼠肾组织中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4相对表达量比较

造模后第 0周, DN组大鼠肾组织中IL-10相对表达量显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);造模后第 8周,DN组大鼠肾组织中IL-10相对表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);造模后第4、12周,2组大鼠肾组织中IL-10相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠肾组织中IL-6、HDAC4相对表达量均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后第 0周,2组大鼠肾组织中TGF-β1相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);造模后第4、8、12周,DN组大鼠肾组织中TGF-β1相对表达量显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图1和表3。

图1 2组大鼠肾组织中IL-6、IL-10、TGF-β1和HDAC4蛋白表达(Western blot)Fig.1 Expressions of IL-6,IL-10,TGF- β1 and HDAC4 protein in renal tissue of rats in the two groups (Western blot)

表3 2组大鼠肾组织中IL-10、IL-6、TGF-β1和HDAC4相对表达量比较Tab.3 Comparison of relative expression levels of IL-10,IL-6,TGF-β1 and HDAC4 in renal tissue of rats between the two groups

2.4 DN大鼠血清IL-6、IL-10、TGF-β1、HDAC4水平与血糖、UACR的相关性

Pearson相关性分析显示, DN组大鼠血清IL-6、TGF-β1水平与血糖呈正相关(r=0.614、0.514,P<0.05),血清IL-10水平与血糖呈负相关(r=-0.448,P<0.05),血清HDAC4水平与血糖无显著相关性(r=-0.177,P>0.05)。DN组大鼠血清IL-6、TGF-β1水平与UACR呈正相关(r=0.405、0.470,P<0.05),血清IL-10、HDAC4水平与UACR无显著相关性(r=-0.134、-0.124,P>0.05)。

3 讨论

DN是糖尿病常见的微血管并发症之一,其发病机制复杂。肾脏局部炎症在促进 DN 的发生和发展中起着重要的作用,其涉及到炎症细胞、炎症因子和多种蛋白激酶[7]。

本研究结果显示,造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠血糖水平及UACR均显著高于对照组,证明DN组大鼠DN模型造模成功。本研究结果显示,造模后第 0周,2组大鼠的体质量比较差异无统计学意义;造模后第 4、8、12 周,DN组大鼠的体质量均显著低于对照组,原因可能为DN模型大鼠机体不能充分利用葡萄糖,通过加速脂肪和蛋白质的分解来补充能量,从而导致体内脂肪和蛋白质大量消耗,出现体质量下降,也进一步证明了大鼠DN模型造模成功。 造模后第 0、4周,2组大鼠的KI比较差异无统计学意义,说明DN早期尽管高血糖可引起体质量逐渐下降,但对肾质量无明显影响;造模后第 8、12周,DN组大鼠的KI显著高于对照组,说明随着时间延长高血糖可促进DN模型大鼠肾脏肥大,加速肾脏损伤,也进一步证明了大鼠DN模型造模成功。

IL-10是一种由多种免疫细胞如B细胞、肥大细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和多种T细胞产生的关键抗炎介质[11]。IL-10可显著抑制肾小球系膜细胞增殖和巨噬细胞浸润[12]。MU等[13]研究发现, IL-10能够减轻慢性肾脏病大鼠肾脏纤维化。JIN等[14]研究发现,IL-10缺乏的小鼠会出现严重肾小管损伤,并伴随有炎症和促纤维化标志物的增加,以及胶原沉积。本研究结果显示,造模后第 0、4、8、12 周,DN组大鼠血清中IL-10水平显著低于对照组;造模后第 0周DN组大鼠肾组织中IL-10相对表达量显著高于对照组,造模后第8周DN组大鼠肾组织中IL-10相对表达量显著低于对照组;此外,DN组大鼠血清IL-10水平与血糖呈负相关;说明,DN进展过程中大鼠血清和肾组织中IL-10表达量较低,且可能介导了肾脏炎症反应和纤维化。

肾脏局部炎症可以激活TGF-β1/Smad信号通路,从而促进DN患者肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质沉积[15-16],并进一步引起肾小管上皮-间充质转化和肾间质纤维化[17-19]。表观遗传组蛋白修饰和TGF-β1信号通路在调节DN肾脏纤维化方面起着重要作用。TGF-β1通过激活组蛋白乙酰转移酶,使其在肾纤维化基因启动子上富集,从而促进纤维化基因的转录,进而促进肾间质纤维化的进展[20]。其中,介导组蛋白乙酰化的HDAC4在DN发病过程中起重要作用。HDAC4可通过诱导炎症反应和细胞凋亡,尤其是通过抑制足细胞自噬,促进肾小球病变和蛋白尿排泄[21-22]。本研究结果显示,造模后第0、4、8、12周,DN组大鼠血清中HDAC4、TGF-β1水平均显著高于对照组;造模后第4、8、12周,DN组大鼠肾组织中TGF-β1、HDAC4相对表达量均显著高于对照组;此外,DN组大鼠TGF-β1水平与血糖、UACR呈显著正相关;说明,TGF-β1介导的炎症反应参与DN的发生发展过程。HDAC4主要介导足细胞损伤,足细胞是肾小球滤过膜的重要组成部分,足细胞损伤会导致大量蛋白尿。本研究结果显示,DN大鼠血清HDAC4水平与血糖、UACR无显著相关性,推测与DN造模时间短、UACR水平相对偏低有关。

4 结论

DN大鼠IL-6、TGF-β1、HDAC4表达上调,IL-10表达下调;此外,DN大鼠血清IL-6、TGF-β1水平与血糖、UACR呈显著正相关,血清IL-10水平与血糖呈显著负相关。本研究结果可为DN抗炎治疗提供新思路。DN发生发展过程较复杂,涉及代谢、炎症、纤维化和表观遗传学改变等多种途径及相互作用,具体作用机制还有待进一步深入探讨。