非小细胞肺癌驱动基因突变与相关临床指标的相关性分析

於樱枝 杨朝晖 朱楚梦 曹学全 蔡小波 顾华敏 卢洪胜

中国癌症报告显示，2020 年中国肺癌发病率占所有癌症的17.9%，致死率占23.8%，发病率与致死率均是众癌之首[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌发病的80%～85%，容易发生转移且预后较差[2]。目前，NSCLC 发病机制尚不清楚，有报道认为是由表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变驱动的[3-5]。研究提示，血清肿瘤标志物中鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）和糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）与NSCLC 患者发生EGFR 突变存在着较强的关联性，与吸烟史、年龄、其他肿瘤标志物等临床相关指标的联合评估可有效提高EGFR 突变的鉴别诊断能力，值得进一步深入研究[6-8]。对疾病分子发病机制与临床病理结果相关性的深入研究可促进疾病个性化治疗的发展。因此，针对NSCLC 的基因突变与临床相关指标的相关性研究非常有必要。二代测序（nextgeneration sequencing，NGS）技术的不断发展逐渐完善了NSCLC 的基因表达谱，促使NSCLC 基因组分型成为疾病精准治疗的重要环节。本研究利用NGS 技术检测NSCLC 样本中常见驱动基因的突变情况，分析驱动基因突变特点与常规血清肿瘤标志物及患者临床病理特征的关系，以期为NSCLC的个性化治疗提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选择台州市中心医院2018 年1 月至2022年11 月收治的120 例初诊且未经过治疗的NSCLC 患者，均经影像学和病理学检查确诊，年龄39～92 岁，其中男65 例，女55 例。收集患者年龄、性别、病史、病理诊断、外周血和影像学检查结果等临床资料，并独立录入安全数据库。

1.2 方法

1.2.1 血清肿瘤标志物检测 提取血样并立即分离血清，保存于-80℃冰箱备用。癌胚抗原（carcinoma embryonic antigen，CEA）、SCC、CA125、细胞角蛋白21 片段抗原（cytokeratin fragment 21-1 antigen，CYFRA21-1）采用雅培化学发光分析仪及其配套试剂检测，胃泌素释放前体（pro-gastrin releasing peptide，Pro-GRP）采用罗氏E411免疫发光分析仪及其配套试剂检测。各肿瘤标志物的检测截断值：CEA 为6.5 μg/L，CA125 为35.0 U/mL、SCC 为2.0 μg/L、Pro-GRP 为63.0 ng/L、CYFRA21-1为3.3 μg/L。所有实验均在室温下重复进行，并进行避光试验。

1.2.2 基因检测 所有患者的肺癌组织均经常规病理检查证实，并进行基因检测。所有样本采用QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒（美国凯杰公司）按说明书提取DNA，通过Qubit dsDNA 检测技术（美国赛默飞世尔公司）进行DNA 浓度测定。肿瘤细胞含量≥10%，DNA 样本总量≥30 ng。采用人多基因突变联合检测试剂盒（广州燃石医学检验所有限公司），定性分析NSCLC患者EGFR、鼠类肉瘤病毒癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（vrafmurine sarcoma viral oncegene homolog B1，BRAF）、c-ros 肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶（ROS proto-oncogene1，ROS1）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、间质上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha，PIK3CA）等9 种驱动基因的多种变异状态，包括点突变、插入缺失、融合（重排）和扩增。通过ABI7500 实时PCR 系统进行扩增建库。基因检测平台为Illumina（NextSeq 550AR）。经NGS 技术进行多种驱动基因检测，操作方法和数据分析均遵循检测平台指南要求。

1.3 统计学处理 采用SPSS 26.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验分析不同临床病理特征及肿瘤标志物水平患者驱动基因突变情况的差异。采用Spearman 秩相关分析驱动基因突变情况与临床病理特征及肿瘤标志物水平的相关性，r＜0.5 为低度相关，0.5≤r＜0.8 为中度相关，r＞0.8 为高度相关。使用AUC 评估临床病理特征及肿瘤标志物对突变类型的诊断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC 患者各驱动基因的突变情况 纳入的120例NSCLC 患者中，EGFR 基因突变83 例，KARS 基因突变13 例，TP53 基因突变15 例，PIK3CA 基因突变8 例，HER-2 基因突变6 例，BARF 基因突变5 例，ROS1 和MET 基因突变各4 例，ALK 基因突变3 例。单一位点突变89 例，多位点突变31 例。9 种驱动基因的单一位点突变分别为EGFR 59 例（49.17%），KRAS 9 例（7.50%），BRAF 5 例（4.17%），ROS1 和HER-2 各4 例（各3.33%），ALK 3 例（2.50%），MET 和TP53 各2 例（各1.67%），PIK3CA 1 例（0.83%）。EGFR、KRAS、BRAF 突变、ROS1 融合的发生率相对较高。检出的83例EGFR基因突变中，单一位点突变59例，主要突变类型为EGFR 19-del 和EGFR L858R，分别为31 例（52.54%）和24例（40.68%）；其次是EGFR ex20-ins、EGFR G719 和EGFR L861Q，分别为2 例（3.39%）、1 例（1.69%）和1 例（1.69%）。EGFR 基因多位点突变24 例，其中合并TP53 基因突变和PIK3CA 基因突变各1 例。

2.2 不同临床病理特征及肿瘤标志物水平患者驱动基因突变情况的差异 临床分期Ⅲ+Ⅳ期患者TP53 突变发生率高于Ⅰ+Ⅱ期患者，发生淋巴结转移患者EGFR 突变发生率高于未转移患者，CEA＜6.5 μg/L 患者ROS1 突变发生率高于CEA≥6.5 μg/L 患者，SCC≥2.0 μg/L 患者PIK3CA 突变发生率高于SCC＜2.0 μg/L患者，Pro-GRP≥63.0 ng/L 患者HER-2 突变发生率高于Pro-GRP＜63.0 ng/L 患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。KRAS、ALK、BRAF 和MET 等基因的突变在不同临床病理特征及肿瘤标志物水平的患者中比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

2.3 单一位点突变组与多位点突变组患者临床病理特征及肿瘤标志物水平的比较 根据基因检测结果显示的突变类型将120 例NSCLC 患者分为单一位点突变组（89 例）和多位点突变组（31 例）。两组淋巴结转移情况、临床分期、血清CEA 和CA125 水平比较，差异均有统计学差异（均P＜0.05）。发生淋巴结转移的患者相较于未发生淋巴结转移的患者具有更高的多基因共突变的频率（P＜0.05），肺癌晚期（Ⅲ期+Ⅳ期）的患者相较于早期（Ⅰ期+Ⅱ期）的患者更易发生多基因共突变（P＜0.01），高血清CEA 水平（≥6.5 μg/L）的病例多基因共突变频率高于低血清CEA 水平（＜6.5 μg/L）的病例（P＜0.05），高血清CA125 水平（≥35.0 U/mL）的病例多基因共突变频率高于低血清CA125 水平（＜35.0 U/mL）的病例（P＜0.05），见表2。

表2 单一位点突变组与多位点突变组患者临床病理特征及肿瘤标志物水平的比较[例（%）]

2.4 驱动基因突变与临床病理特征及肿瘤标志物水平的相关性分析 Spearman 相关性分析显示，NSCLC患者发生突变的类型与淋巴结转移和血清CEA、CYFRA21-1 水平中度相关，与CA125 和临床分期高度相关，见表3。

表3 驱动基因突变与临床病理特征及肿瘤标志物水平的相关性分析

2.5 临床病理特征及肿瘤标志物水平对驱动基因突变类型诊断效能评估 患者年龄、性别、吸烟史、淋巴结转移情况、临床分期、CEA、CA125、SCC、Pro-GRP、CYFRA21-1 在诊断突变类型时的AUC 均＞0.5，其中淋巴结转移（AUC=0.602，P＜0.01）、临床分期（AUC=0.621，P＜0.01）、血清CEA（AUC=0.618，P＜0.05）具有较好的诊断效能，见表4。

表4 临床病理特征及肿瘤标志物水平在突变类型诊断中的效能评估

3 讨论

肺癌是全球癌症致死率最高的癌种，占癌症死亡总数的18%[9]。随着生活习惯的变化，NSCLC 的发病年龄逐渐趋于年轻化，约30%的晚期患者发生转移[10]。已有研究表明，NSCLC 患者在未得到有效治疗的情况下中位生存时间仅为1 个月[10]。随着小分子抑制剂和免疫检查点抑制剂的引入，NSCLC 患者尤其是晚期患者个性化治疗的需求越来越大，传统的治疗方式已经不足以缓解现在临床的治疗负担[11-14]。近年来，特异性分子靶向药物的兴起加速了个性化治疗的发展，显著提高了患者的总生存率，有效改善患者预后。随着抗体-药物偶联物、细胞因子治疗、嵌合抗原受体-T 细胞治疗等新型治疗方式的出现，NSCLC 患者的治疗前景得到了很大的拓展[15-16]。随着基因测序技术在临床及临床研究中的广泛应用，基于NSCLC 的分子层面的研究逐渐深入，引导患者的个性化治疗的方案逐步完善，迎来了靶向驱动基因指导下的分子治疗的新高潮[17-19]。EGFR、ALK、KRAS、ROS1、RET 等驱动基因的检测在指导患者用药中发挥了重要的作用[20]。目前，EGFR 家族引导的靶向治疗是最具有验证性和广泛应用的前景。酪氨酸激酶活化是肿瘤生长与发生变化的重要条件，因此对这条活化通路的精准打击与抑制成为抑制肿瘤生长实现抗肿瘤作用的重要策略。EGFR 酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对携带有EGFR 基因突变的NSCLC 患者有较好的治疗效果，这更加激发了临床对NSCLC 靶向治疗的信心[21]。NGS 在少量样本的条件下仍然可获得多基因多位点的突变信息，并利用这些突变信息为患者选择合适的靶向治疗，也在一定程度上引导了新的靶向药物的研究[22]。

本研究纳入了120 例NSCLC 病例，具有单一突变位点的病例中经典突变EGFR 19-del 和EGFR L858R突变占93.22%，其他突变包括EGFR ex20-ins、EGFR G719 和EGFR L861Q 等。除EGFR 以外，其他基因的突变频率均未发现与患者的年龄、性别、吸烟史、临床分期及血清肿瘤标志物等存在相关性。进一步聚焦研究EGFR 基因突变与相关临床指标的相关性发现，具有淋巴结转移的晚期NSCLC 患者，发生EGFR 突变的概率更高。提示探讨基因突变与临床病理特征的关系对评估患者基因突变状态有利。

血清肿瘤标志物是一类循环蛋白质分子，由肿瘤细胞或身体的其他细胞产生，以鉴别癌症或某些良性疾病[16]。肿瘤标志物表达水平的改变具有一定的预测预后和在随访期间评估治疗反应的价值。有研究发现血清CA125、CEA、CYFRA21-1、SCC 和pro-GRP 水平与NSCLC 疾病进程相关[23]。Shoji 等[24]研究认为EGFR 基因突变频率与患者血清CEA 水平呈正相关，即血清CEA 可以预测EGFR 突变。本研究结果显示，高血清CEA 水平（≥6.5 μg/L）的NSCLC 患者发生多位点共存突变的频率（71%）显著高于低血清CEA 水平（＜6.5 μg/L）患者（P＜0.05）；就相关性分析结果来看，高血清CEA 水平与发生多位点共存突变具有相关性（P＜0.05），这提示血清CEA 水平可能与NSCLC 患者驱动基因多位点突变存在正相关。同时，高血清CA125 水平（≥35.0 U/mL）患者发生多位点共存突变的频率明显高于低血清CA125 水平低患者（P＜0.05），即高血清CA125 水平与发生多位点共存突变具有相关性（P＜0.05），提示CA125 浓度升高与多位点突变率存在正相关。而CYFRA21-1、SCC 和Pro-GRP 的表达差异未检测出与NSCLC 患者驱动基因多位点突变率存在相关性。在具有单一突变位点的病例中，CYFRA21-1、SCC和Pro-GRP 的表达也不具有统计学差异。与此同时，淋巴结转移（P＜0.05）和临床分期（P＜0.01）作为可以提示疾病进展的两项临床指标也被检测出与多位点共存突变的发生具有显著相关性。这些结果提示分析患者的基因突变情况与其临床病理特征的和肿瘤标志物水平关系对患者基因突变类型诊断有不可忽略的重要性。

本研究利用淋巴结转移、临床分期、CA125 与血清CEA 水平对多位点突变的患者进行筛选，遗憾的是单项标志物进行诊断的性能并不理想。AUC 值最高的为临床分期，仅有0.621，灵敏度虽高达0.969，但特异度仅为0.273，其诊断性能远远不足以对患者的基因突变类型进行有效区分。寻找新的更具有特异性的多项标志物，对患者血清水平进行多标志物联合检测的诊断性能或许能够有效地提升对多突变位点的患者的筛查性能。有研究回顾性分析了210 例NSCLC 患者的基因表达及临床特征信息，结合几项多指标预测基因突变AUC 值可达0.80，这也提示了多指标联合检测的有效性[25]。本研究还对现有临床指标及肿瘤标志物进行了建模分析，并未找到具备预测价值的模型，可能与标志物特异性不强有关，另外样本层次的丰富度可能也是一大影响因素。后续研究通过扩大样本量，纳入更多具备特异性的肿瘤标志物可能会优化模型，提升模型的特异度和灵敏度，因此需要开展多中心大样本的研究。

综上所述，NSCLC 患者EGFR 基因突变可与其他驱动基因突变共存，且多位点突变共存的发生频率与淋巴结转移、临床分期、血清CEA 和CA125 水平有显著相关性。通过NGS 发现的多位点共存型突变及少见突变应引起重视，可提示临床及时调整治疗方案，为NSCLC 的精准治疗提供辅助策略。分析驱动基因突变特点与常规血清肿瘤标志物及患者临床病理特征的关系，可为NSCLC 的个性化治疗提供参考。