脂肪干细胞与放射损伤成纤维细胞共培养后细胞因子表达的差异

秦岭 阎海萍 尹小芳 杨超 栗颖利 李敏

[摘要]目的：探討脂肪干细胞（Adipose derived stem cells，ADSCs）与放射损伤成纤维细胞（Fibroblast，Fb）共培养后细胞因子表达的差异。方法：使用剂量8 Gy的X线放射源，对大鼠的成纤维细胞进行单次照射，建立ADSCs与放射后成纤维细胞共培养模型。分别把未干预的成纤维细胞设为空白对照Fb1组，放射后成纤维细胞设为Fb2组，ADSCs与放射后成纤维细胞共培养组设为Fb3组，利用蛋白质芯片检测各组差异表达的细胞因子，并通过Elisa检测验证。结果：研究结果发现Fb2组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表达水平低于Fb1组（P＜0.05），Fb3组GM-CSF表达水平高于Fb2（P＜0.01）；Fb3组血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表达水平高于Fb2组（P＜0.05）；各组表皮细胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）含量差异无统计学意义。结论：ADSCs与放射后成纤维细胞共培养后多种生长因子、黏附因子、趋化因子上调，部分炎性因子下调；ADSCs可能主要通过VEGF和GM-CSF促进成纤维细胞放射损伤的修复。

[关键词]脂肪干细胞；成纤维细胞；放射损伤；细胞因子；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；血管内皮生长因子

[中图分类号]R622    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）07-0086-04

Differences in Cytokines Expression after Co-Culture of Adipose Stem Cells with Irradiated Fibroblasts

QIN Ling1，YAN Haiping2，YIN Xiaofang1，YANG Chao3，LI Yingli4，LI Min5

（1.The PLA 960th Hospital Graduate Training Base of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，Liaoning，China; 2.Jinan's Eleventh Leaving Cadre Recuperation Center of Shandong Provincial Military Region，Jinan 250013，Shandong，China; 3.Plastic Surgery of PLA Naval Medical Center，Shanghai 200433，China; 4.Department of Plastic Surgery，960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China; 5.Department of Nuclear Medicine， 960th Hospital of PLA，Jinan 250000，Shandong，China）

Abstract： Objective  To investigate the difference in cytokines expression after co-culture of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Methods  An X-ray radiation source of 8 Gy was used to illuminate rat fibroblasts to establish a co-culture model of ADSCs and radiation-damaged fibroblasts. Unintervened fibroblasts were set as blank control Fb1，radiation damaged fibroblasts as Fb2， and ADSCs with radio-injured fibroblasts as Fb3. Differentially expressed cytokines were detected in each group using protein microarray， which were verified by Elisa. Results  The expression of granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF） in Fb2 group were lower than that in Fb1 group （P＜0.05），while the expression of GM-CSF in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.01）; Moreover，the expression of vascular endothelial growth factor（VEGF） in Fb3 group were higher than that in Fb2 group （P＜0.05）. However， there was no significant difference in epidermal growth factor（EGF） and platelet derived growth factor（PDGF） content in each group. Conclusion  Some growth factors， adhesion factors， and chemokines were up-regulated while some inflammatory factors were down-regulated after co-culture of ADSCs with radiation-damaged fibroblasts. ADSCs may promote the repair of fibroblast radiation damage mainly through VEGF and GM-CSF.

Key words： adipose derived stem cells; fibroblast; radiation damage; cytokines; granulocyte-macrophage colony stimulating factor; vascular endothelial growth factor

皮肤作为放射损伤最常累及的器官，约90%的患者接受放射性治疗后会出现相应症状。目前常用的乳膏、皮瓣移植以及手术切除修复等治疗方式的有效性仍缺乏证据[1]。Fb的迁移和增殖被认为在很大程度上影响伤口收缩、细胞外基质的沉积和组织的重建[2]。而大量成纤维细胞的放射损伤成为了放射性皮肤损伤难愈合的重要原因之一。但是单纯使用成纤维细胞治疗，可能会导致皮肤组织纤维化[3]。许多研究发现ADSCs可以通过分泌细胞因子和黏附分子等物质修复放射损伤后的成纤维细胞与内皮细胞[4，6]，并且脂肪来源干细胞对增生性瘢痕成纤维细胞能够发挥抗纤维化作用[7]。但是，目前尚不明确ADSCs主要通过哪些细胞因子来影响放射损伤后成纤维细胞的修复。

本实验采用实验组前期设计的ADSCs与放射损伤成纤维细胞共培养模型，通过蛋白芯片高通量筛查ADSCs可能通过哪些细胞因子促进放射后成纤维细胞的修复，并进行Elisa定量检测来验证。

1  材料和方法

1.1 主要仪器与试剂：直线加速器（西门子，德国）；超净工作台（青岛 海尔）；CO2细胞培养箱（Thermo scientific，美国）；倒置显微镜（Olympus，日本）；流式细胞仪（Mihenyi Biotec，德国）；GenePix 4000B芯片扫描仪（Axon，美国）；0.4μm细胞共培养皿（Corning，美国）；DMEM培养液、胎牛血清、胶原酶Ⅰ型、胰蛋白酶、Dispase酶（Gibco，美国）；戊巴比妥钠（Signa，美国）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，上海）；RIPA裂解液（碧云天，上海）；酶标仪（Thenno Scientific，美國）；Elisa检测试剂盒（碧云天，上海）；CD29、CD44、 CD31、CD45抗体（Miltenyi Biotec，德国）；波形蛋白（Vimentin）抗体（CST，美国）。

1.2 实验动物：选取6～8周龄雄性SD大鼠10只，每只体重300～400 g，由长海医院动物实验中心提供。

1.3 大鼠ADSCs的提取、培养与鉴定：取10只SD大鼠脱颈处死，75%酒精浸泡10 min后，分离腹股沟脂肪，用1%双抗PBS冲洗。在适量PBS中尽量剪碎脂肪后加入等体积胶原酶Ⅰ型，37℃、100 r/min摇床消化50 min。离心后弃上清，加入适量含胎牛血清（FBS）的DMEM终止消化，经过75μm筛网过滤后离心，弃上清，加入适量培养液重悬后移至培养皿中，于37℃、5% CO2孵箱中培养，每3 d换液一次。待细胞长至90%融合度后传代用于表面CD分子鉴定及定向诱导分化，具体细胞验证和实验步骤参考课题组前期方法[8]。

1.4 大鼠成纤维细胞的提取、培养及鉴定：取SD大鼠腹部皮肤，分离脂肪等其他组织后用PBS冲洗，加入Dispase酶消化过夜，温度为4℃。分离真皮与表皮组织，尽量剪碎真皮组织后放入10 ml含0.25%胰酶DMEM培养皿中，于标准状态下培养箱孵育2 h。用75 μm筛网过滤组织液后离心弃上清，重悬后将所得细胞悬液转移在配置好的培养液中（含10% FBS的DMEM培养基）。每2 d换一次液，90%融合度后传代，做Vimentin蛋白表达检测[8]。

1.5 分组及蛋白质提取：Fb1组为空白对照的成纤维细胞，Fb2组为接受过8 Gy X线照射后的成纤维细胞，Fb3组为照射后与ADSCs共培养的成纤维细胞。待第3代ADSCs和真皮成纤维细胞长至80%～90%后消化后计数。先准备3块6孔板，各组6孔板每孔接种1.5×105个Fb，加培养液后置于细胞培养箱内。ADSCs以1.0×105个/孔的密度接种于共培养组Transwell 6孔板上室中，加培养液置于37℃，5% CO2培养箱内。24 h后换液，在常规6孔板每孔中加入2 ml培养液，Transwell 6孔板每个上室和下室中加1 ml培养液。Fb2组和Fb3组成纤维细胞利用直线加速器进行X线照射，能量为6 MV，距离100 cm，剂量8 Gy。照射完成后立即将接种ADSCs 的Transwell 6孔板上室放入Fb3组下室中，所有6孔板置于37℃、5% CO2培养箱内。48 h后收集各组成纤维细胞培养液上清离心后加入蛋白裂解液提取总蛋白[9]。

1.6 细胞因子蛋白芯片检测：取各组含总蛋白的细胞培养液上清，分别为Fb1组蛋白、Fb2组蛋白和Fb3组蛋白。每组总蛋白液以13 200 rpm离心15 min后，取每组上清400μl于500 ml 1×PBS透析液中，4℃摇床过夜。次日以10 000 rpm离心5 min。BCA法蛋白定量，加入Labeling reagent tube（Item B），室温震荡30 min，每5 min轻摇一次。所有样品加入3μl Stop Solution混匀。参照Raybiotech公司提供的蛋白芯片检测流程以及试剂盒进行操作，取透析后样品200μl，加入Blocking Buffer至终体积400μl后进行芯片检测。芯片干燥后，于4℃封闭，每孔加入800μl Blocking Buffer，除去Blocking Buffer后按照步骤芯片经过1×Wash BufferⅠ和1×Wash BufferⅡ洗涤后，1 000 rpm离心后甩干，上Axon GenePix 4000B芯片扫描仪。

1.7 ELISA检测：取上述Fb1、Fb2和Fb3组含蛋白上清，利用ELISA检测验证并定量蛋白质芯片初筛的结果。操作具体过程按照ELISA检测试剂盒说明书以及相关参考文献[9]。每次检测均为3孔，实验重复至少3次。

1.8 统计学分析：细胞因子蛋白芯片检测和Elisa检测等数据汇总Excel统计数值。多次重复实验后所得数据用（x ?±s）表示。各组实验数据通过SPSS 18.0软件分析，采用多组单因素方差分析处理数据，P＜0.05为差异有统计学意义。GraphPad Prism 6.0制作图表。

2  结果

2.1 ADSCs与大鼠成纤维细胞形态学观察与鉴定：ADSCs 2 d后贴壁，逐渐由多角形变为长梭形。流式细胞仪检测ADSCs表面标记结果显示CD29、CD44高表达，而CD45、CD31低表达。经过成脂诱导培养的ADSCs胞浆内可见脂滴，油红O染色后脂滴变为红色。经成骨诱导后ADSCs由梭形变成多角形，显微镜下可观察到钙盐结晶沉积及矿化结节，碱性磷酸酶及茜素红染色阳性。成纤维细胞亦呈梭形或多角形，免疫细胞化学染色后波形蛋白高表达[10]。

2.2 蛋白质芯片结果：蛋白芯片结果显示，相比于Fb1组，Fb2组中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、表皮细胞因子（Epidermal growth factor，EGF）和血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）等大部分细胞因子下调。Fb3组比Fb2组上调的细胞因子包括酪氨酸激酶受体-2（Tyrosine kinase receptor-2，TIE-2）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、金属蛋白酶组织抑制物-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、分泌型磷蛋白1（Secretory phosphoprotein-1，SPP1）、基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、神经生长因子受体（Neurotrophic factor receptor，NGFR）、GM-CSF、L选择素（CD62L）、VEGF、CD80、EGF、PDGF等；下调的细胞因子包括肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配（Tumor necrosis factor-associated apoptosis-inducing ligand，TRAIL）、基质金属蛋白酶组织抑制物-3（Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-3，TIMP-3）、β神经生长因子（Beta nerve growth factor，β-NGF）、IL-3、CD54、IL-12、IL-4、IL-10等，见图1。通过对比各组差异细胞因子含量发现在成纤维细胞放射损伤后下调，经过ADSCs共培养后上调的细胞因子排名靠前为GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。

2.3 Elisa结果：由于采用半定量蛋白芯片检测细胞因子，所以利用Elisa检测对排名靠前几个细胞因子进行定量验证。Elisa检测结果显示Fb2组GM-CSF表达量较Fb1组少，差异有统计学意义（P＜0.05），Fb3组GM-CSF表达量较Fb2组多，差异有统计学意义（P＜0.01）。Fb3组VEGF表达量较Fb2组多，差异有统计学意义（P＜0.05）。EGF和PDGF含量非常少，且各组间含量差异没有统计学意义，见图2。

3  讨论

随着患者不断增长的放疗需求，脂肪干细胞的移植成为放射性皮肤损伤治疗的一种非常有前景的方法。虽然大量研究已经证实ADSCs能够通过旁分泌多种细胞因子促进成纤维细胞增殖以及皮肤创面的愈合[11-12]。但在放射性皮肤损伤中ADSCs通过哪些细胞因子参与修复仍需要进一步探究。

课题组在前期证实ADSCs能够促进放射损伤的成纤维细胞修复的基础上[10]，利用共培养皿上室的聚碳酸酯膜可以通过细胞因子的特点，对Fb1组、Fb2组和Fb3组细胞因子进行蛋白质芯片检测和Elisa检测，发现成纤维细胞在接受照射后几乎所有细胞因子的表达下降，而ADSCs干预的Fb3组较Fb2组中多种生长因子、趋化因子、黏附因子上调，部分炎性因子下调。其中在放射损伤组下调而在ADSCs干预的Fb3组上调的细胞因子排名靠前的是GM-CSF、VEGF、EGF和PDGF。这与多项ADSCs治療放射性伤口的研究中发现的VEGF表达上调[14-16]和炎症反应减轻一致[13-14]。靠前的这些细胞因子里差异含量较明显是GM-CSF和VEGF，而EGF和PDGF含量相对较少，与各组相比差异无统计学意义，这提示ADSCs可能是主要通过VEGF和GM-CSF干预放射损伤后成纤维细胞的修复。

综上所述，本研究预测了ADSCs修复放射损伤成纤维细胞前后差异细胞因子，结果发现ADSCs可能主要通过VEGF和GM-CSF干预放射损伤后成纤维细胞的修复。但本研究只检测一部分常见的细胞因子，ADSCs还可能通过其他细胞因子或外泌体等介质参与放射损伤成纤维细胞的修复。另外，实验组前期发现在ADSCs修复放射损伤成纤维细胞后信号通路主要富集在PI3K/AKT与MAPK上[9]。这与Liu等[17]利用人脐带间充质干细胞治疗大鼠放射性皮肤溃疡后创面VEGF表达上调和PI3K/AKT信号通路的激活相同。所以这将为我们验证GM-CSF与VEGF和PI3K/Akt与MAPK通路在ADSCs修复放射损伤成纤维细胞过程中的相关性奠定了基础。

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[收稿日期]2022-04-20

本文引用格式：秦嶺，阎海萍，尹小芳，等.脂肪干细胞与放射损伤成纤维细胞共培养后细胞因子表达的差异[J].中国美容医学，2023，32（7）：86-89.