合生元儿童成长奶粉功能性评价

袁紫晴，陶芷茵，孙晓霞，潘锦蓉，林 沁，林绮琪，郑倩望＊

1 华南农业大学食品学院，广东广州 510640

2 合生元（广州）健康产品有限公司，广东广州 510610

0 引言

牛奶中含有蛋白质、脂质、糖类、矿物质（尤其是钙和磷）和多种维生素族群等基础营养元素，是婴幼儿发育重要的营养补充剂，在增强免疫力、提升骨质健康上有重要作用。一些随机对照试验研究发现，青少年日常饮食中补充牛奶可有效增强整个臀部和脊柱的骨骼密度[1]；12 岁的青春期女性连续18 个月每天摄入1 份（568 mL）的全脂或低脂牛奶，可显著提高骨矿物质的获取能力[2]。还有研究发现，低免疫力斑马鱼连续食用一些与牛奶含量相似的乳制品，如低温酸奶、常温纯牛奶和冷冻酸奶冰淇淋等，4 d后，动物体内的免疫细胞，如吞噬细胞、淋巴细胞等数量显著增加，免疫能力也显著增强[3]。

儿童成长过程需要补充其他营养元素来满足发育需要、提高身体素质和增强免疫力。中国《GB19644—2010 食品安全国家标准乳粉》规定了儿童配方奶粉的产品执行标准，但与2021年落实的《GB 10765—2021 食品安全国家标准婴儿配方食品》有所不同，它针对大于36月龄以上的人群食用，产品的执行标准不及婴幼儿奶粉严格[4]。一般来讲，配方食品中蛋白质、碳水化合物含量的要求，目的是让儿童能更科学、更均衡地生长，避免体重过度增长[5]。如在儿童配方奶粉中添加功能性物质，例如低聚半乳糖、乳铁蛋白和二十二碳六烯酸（DHA）等。低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）是一种常见的益生元，能刺激人体肠道益生菌群生长，促进对矿物质吸收，从而调节人体骨骼发育，增强免疫能力[6，7]。乳铁蛋白是来自母乳中的一种活性成分，能与铁离子结合[8]，显著提升人体免疫能力和改善机体营养结构[9，10]。另外，饮食中合理添加DHA也能有效提高机体免疫功能[11]。

调查显示，市面上的儿童奶粉很少在原料上添加GOS等活性物质[12，13]。因临床试验周期长、构建模型难度大准确度低，所以本研究使用了更加方便精准的动物试验，对比两款奶粉在体重、骨密度、骨强度、血清钙和增强大鼠免疫力的作用情况，从而为该年龄段儿童提供更科学、优良的配方奶粉。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

21 只4 周龄SD雄性大鼠，饲养于华南农业大学实验动物中心，许可证号为SYXK（粤）2022-0136；动物实验证明编号为No.00317301。饲料为辐照灭菌实验鼠生长繁殖饲料，除鸡肉粉、鱼粉、豆粕等粗粮外，还添加一些微量元素、维生素。

喂养奶粉为委托方公司提供的合生元儿童成长奶粉（金盖）（简称“金盖组”）和合生元儿童成长奶粉（蓝盖）（简称“蓝盖组”）。

大鼠白细胞介素2（Interleukin，IL-2）ELISA试剂盒、大鼠免疫球蛋白M（Immunoglobulin，IgM）ELISA试剂盒、大鼠骨钙素（Osteocalcin BGP）OCN ELISA试剂盒、大鼠组织蛋白酶K（Cathepsin-K，Cath-K）ELISA试剂盒、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）ELISA试剂盒，泉州睿信生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Super Nova®Micro-CT，平山医疗科技（昆山）有限公司；动物牵拉系统Electroforce 323，美国TA仪器沃斯特公司；超纯水系统FastPure-B，联羽有限公司；台式离心机，德国艾本德有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 奶粉的配方和营养成分

金盖组配料表：全脂乳粉、脱脂乳粉、固体玉米糖浆、乳糖、低聚半乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、乳铁蛋白、酒石酸氢胆碱、牛磺酸、动物双歧杆菌Bb-12（活性益生菌的活菌数≥1×106CFU/g）、醋酸视黄酯、胆钙化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、L-抗坏血酸钠、烟酰胺、叶酸、D-泛酸钙、D-生物素、碳酸钙、柠檬酸钙、硫酸铜、硫酸亚铁、碳酸镁、硫酸锰、亚硒酸钠、柠檬酸锌。

蓝盖组配料表：全脂乳粉、脱脂乳粉、固体玉米糖浆、乳糖、二十二碳六烯酸油脂（DHA）、酒石酸氢胆碱、牛磺酸、动物双歧杆菌Bb-12（活性益生菌的活菌数≥1×106CFU/g）、醋酸视黄酯、胆钙化醇、dl-α-醋酸生育酚、植物甲萘醌、硝酸硫胺素、核黄素、盐酸吡哆醇、氰钴胺、L-抗坏血酸钠、烟酰胺、叶酸、D-泛酸钙、D-生物素、碳酸钙、柠檬酸钙、硫酸铜、硫酸亚铁、碳酸镁、硫酸锰、亚硒酸钠、柠檬酸锌。

两款奶粉的成分区别主要为：金盖组含有低聚半乳糖，而蓝盖组不含；蓝盖组中的DHA含量比金盖组高出90.5%。

合生元儿童成长奶粉（金盖）和合生元儿童成长奶粉（蓝盖）的营养成分如表1所示。

表1 金盖组和蓝盖组营养成分表

1.3.2 动物试验及采食量和体重记录

21 只4 周龄SD雄性大鼠进入动物房后随机分为3 组，分别为对照组、奶粉组（金盖组和蓝盖组），每组7 只进行1 周适应性喂养，自由采食及饮水，每天进行12 h 交替光照，室内温度设置为恒温（24±2）℃。适应性喂养后对大鼠进行为期8 周的奶粉补充。

奶粉每天现配现用。分别称取金盖组、蓝盖组适量加入50 ℃温水中，使其终浓度为300 mg/mL，具体灌胃剂量根据大鼠体重增长情况调整，为2～3 mL/次，灌胃时间为每天9：00及15：00。

每天记录大鼠采食量，每周记录大鼠体重。

1.3.3 样品采集

对大鼠注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉处理，取大鼠全血，在4 ℃下4000 r/min离心10 min，吸取上清液得到血清，放入-20 ℃待测。测量大鼠体长（鼻尖至肛门），取两侧股骨，剔除多余肌肉筋膜及结缔组织后放于10%的福尔马林固定液中待测。

1.3.4 大鼠股骨骨微结构测量

将保存于固定液中的股骨取出，通过Micro-CT扫描影像系统对股骨的骨小梁和骨皮质部分进行扫描。测量计算得出骨密度、骨小梁分离度、骨小梁厚度、骨皮质厚度。采用三点弯曲测定大鼠股骨骨强度。

1.3.5 血清中对应数据的测量

取存于-20 ℃的待测大鼠血清，采用生化方法测得样品中的钙磷含量，并且采用 ELISA试剂盒测定大鼠血清钙含量。

1.4 数据处理与分析

试验数据均采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学处理，试验相关结果以平均值（mean）±标准误（SE）表示；采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用S-N-K和LSD事后检验法。

2 结果与分析

2.1 奶粉干预对大鼠体重、体长及摄食量的影响

由图1A和图1B可知，三组大鼠的体重和体长均无显著差异。与该品系雄性大鼠体重相比（试验周期第8 周时，大鼠周龄为12 周，参考体重为460 g），三组大鼠体重均处于该品系大鼠正常范围的上限，并未显现超重、营养不良症状。

图1 两款奶粉干预对大鼠体重、体长及大鼠每日摄食量的影响

三组大鼠的饲料摄食量变化结果如图1C可知，与对照组相比，两款奶粉组大鼠的饲料摄食量下降。含有GOS的金盖组下降幅度更大，并有显著差异性，但三组的大鼠体重均处于正常水平且无明显差异。张园园指出，GOS作为一种益生元能增强大鼠饱腹感，减少大鼠对饲料进食[14]，从而避免大鼠肥胖风险。而奶粉本身含有能量和蛋白质等其他营养元素足以支撑健康发育，所以大鼠降低饲料摄入没有出现体重下降或因食量减少而诱导其他健康问题。

2.2 奶粉组干预对大鼠骨强度和骨密度的影响

三点弯曲原理是将待测样品放在两个支撑点上，向中点施加一个向下的载荷，当3 个接触点在样品上形成2 个相等的力矩时即发生三点弯曲，样品的中点处随即断裂（图2）。该原理也适合测量生物的骨骼强度，是研究骨骼生物力学性能的重要检测手段。

图2 三点弯曲力学示意图

骨强度是人体抗骨折能力的评估指标，代表骨的韧性和载荷能力。骨强度提高时，可减少骨折的发生可能。本试验利用三点弯曲测量3 组大鼠的两侧股骨骨强度，结果如图3-A所示。与对照组相比，奶粉组结果均有提高，其中金盖组大鼠股骨骨强度比对照组增加了15.2%，蓝盖组比对照组增加了4.1%。该结果说明了两种奶粉都能有效增强大鼠的股骨骨强度。

图3 两款奶粉干预对大鼠股骨骨强度和骨密度的影响

本试验采用Micro-CT分别扫描大鼠股骨骨皮质及骨小梁，得到骨密度（3B和3C）。结果显示，奶粉组大鼠的骨皮质骨密度和骨小梁骨密度与对照组相比，均无显著性差异（P＞0.05），说明两款奶粉对骨皮质骨密度及骨小梁骨密度增强效果不明显。

2.3 奶粉组对大鼠骨代谢的影响

虽然骨密度是影响骨强度和骨折的主要因素，但大多数患有脆骨病患者的骨密度数值变化在合理范围内波动[15]，只从骨密度数值变化判断骨骼健康情况不精确，应从骨骼的微观结构探究其对骨折是否产生重要影响。

对采用Micro-CT扫描大鼠股骨骨皮质及骨小梁的结果进一步分析，得到骨小梁厚度、骨皮质厚度、骨小梁分离度及结构模型指数（图4）。由图4A可知，奶粉组均显著增加大鼠的骨小梁厚度，其中蓝盖组比对照组增加25.7%，金盖组比对照组增加20.8%。三组大鼠的骨皮质厚度结果如图4B所示，与对照组相比，奶粉组在骨皮质厚度方面没有显著变化；在骨小梁分离度方面，由图4C可知，与对照组相比，奶粉组都减少了大鼠的骨小梁分离度，其中金盖组骨小梁分离度降低23.6%，与对照组具有显著性差异，而蓝盖组和对照组没有显著性差异。

图4 奶粉组对大鼠骨代谢的影响

骨皮质和骨小梁的结构关系如图5所示。骨皮质和骨小梁是人体骨骼的重要结构，两者相互依存。骨皮质（红色区域）为骨小梁提供坚硬的外部保护，骨小梁（白色区域）为骨皮质提供内部支撑。当骨皮质骨厚度和骨小梁厚度增加时，骨小梁的分离度随之下降，而骨骼的硬度增强，发生骨折的概率降低。其中，骨小梁骨密度是骨代谢的反映指标[16]，当骨密度增加时，骨合成代谢大于分解代谢，反之亦然。本试验数据中，皆反映大鼠骨骼强度增强（图4A、4B、4C），且奶粉干预组的大鼠骨小梁骨密度增加（图3C），说明奶粉摄入有利于大鼠骨骼的合成代谢。

图5 骨皮质和骨小梁的结构关系

本试验用结构模型指数SMI定义骨小梁的板状和杆状程度，即对于拥有相同厚度的骨小梁，通过其“板”和“杆”的形态分析骨骼疏松情况，其数值介于0～3之间。当骨小梁为板状结构时，SMI为0，杆状时为3。当骨骼发生骨质疏松时，骨小梁结构则从板状转为杆状，SMI值也随之增大[17]。由图4D可知，与对照组相比，奶粉组对大鼠股骨的结构模型指数影响没有显著性差异。

2.4 奶粉组对大鼠血清钙磷含量和IgM含量的影响

骨骼是人体的重要器官，能为人体结构提供移动性和支撑性，也是钙磷等矿物质的主要储库[18]。本文采用生化分析方法检测大鼠血清中的钙磷含量，得到结果如图6A、6B所示。两款奶粉添加对对大鼠血清磷含量没有影响，但是血清钙含量在奶粉组出现下降，这是由于试验所使用的大鼠生长维持饲料是高钙配方，钙含量比两款儿童奶粉更高，所以对照组因摄食量较奶粉干预组高，钙含量更高。由于奶粉补充后提高大鼠的饱腹感，大鼠采食量降低，所以奶粉组的血清钙含量降低。值得注意的是，尽管金盖组大鼠的摄食量显著低于蓝盖组（图1C），但其血清钙离子浓度却高于蓝盖组，而两者的配方中钙含量是一致的（表1）。推测是由于金盖组中添加2%的GOS，而之前也有研究提示额外补充GOS能促进矿物质的吸收[19]。

图6 奶粉组对大鼠血清磷钙含量和IgM含量的影响

IgM是B细胞抗原受体的主要成分，是初次体液免疫应答中最早出现的抗体，所以通常作为体液免疫的指标。分析结果可知（图6C），蓝盖组和金盖组大鼠的IgM值比对照组分别提高8.5%和5.9%，对大鼠的免疫调节都有一定效果，但蓝盖组的调节效果更强。该结果可能与蓝盖组中DHA有关，由表1可知，蓝盖组中DHA的含量比金盖组高出90.5%。而DHA是调节体液免疫功能的主要基础物质[20]，所以蓝盖组对机体免疫的调节功能对比其他两组有着显著的效果。

3 结论

本试验以合生元（广州）健康产品有限公司提供的合生元儿童成长奶粉（金盖组）和合生元儿童成长奶粉（蓝盖组）为例子，评估食用配方奶粉和不额外食用配方奶粉、两款奶粉中含有乳铁蛋白和GOS分别对大鼠的体重、骨密度、骨强度、血清钙及机体免疫的影响。最后得出两款合生元儿童奶粉对大鼠骨骼生产、机体免疫能力都有正向作用，由此推断两款儿童奶对儿童骨骼、免疫发育可能起到促进作用。