叶酸中残留溶剂三氯丙酮气相色谱检测方法
2023-08-08王莉莉王晓凤李焕君张晓灿马凤霞刘晓莲马宁宁
王莉莉，王晓凤，李焕君，张晓灿，马凤霞，康 倩，王 丽，刘晓莲，马宁宁
（河北冀衡药业股份有限公司，河北 衡水 053000）
0 引 言
叶酸（Folic acid） 又名维生素B9，是一种水溶性的维生素。叶酸在肠道吸收后，经门静脉进入肝脏，在肝内二氢叶酸还原酶的作用下，转变为具有活性的四氢叶酸，四氢叶酸是体内转移“一碳基团”的载体，是DNA 合成的主要元素。
在临床上，孕妇服用叶酸可预防胎儿唇腭裂，神经管畸形等病变。另外，维生素C 与叶酸同服，可抑制叶酸在胃肠中吸收，大量的维生素C 会加速叶酸的排出。
目前，国内上市有叶酸原料、叶酸片、注射用叶酸以及叶酸复方制剂。叶酸合成工艺一般都是以N- 对氨基苯甲酰-L 谷氨酸、2,4,5- 三氨基-6- 羟基嘧啶硫酸盐、三氯丙酮为基础原料，经反应制得叶酸粗品，经酸溶、碱溶、精制等纯化得叶酸原料药。
叶酸制备工艺相对成熟，在生产过程中以三氯丙酮作为原料，可能会残留在成品叶酸中。各国药典均没有关于叶酸残留溶剂三氯丙酮的检测方法。按照国际制药指南ICHQ3C，三氯丙酮属于对人体有害的有机溶剂，所以，控制残留溶剂非常必要。
本研究采用气相色谱法，建立了叶酸原料药中三氯丙酮残留溶剂的测定方法及方法学研究，主要包括方法专属性、溶液线性范围、方法定量限及检测限、方法精确度、溶液稳定性、耐用性等方面的探讨，旨在为叶酸中残留溶剂的分析检测及质量标准的建立提供参考。
本研究开发了叶酸残留溶剂三氯丙酮的定量检测方法，为叶酸的生产提供了重要的理论依据，同时也达到了提高叶酸质量的目的。
1 实验部分
1.1 实验用分析仪器与试剂
1.1.1 主要仪器
（1） 分析天平：QUINIX124-1CN 型，赛多利斯。
（2） 气相色谱仪：Clarus 580 型，PE 气相色谱仪。
（3） 超纯水仪：Milli-Q IQ 7000 型，德国默克密理博。
（4） 数控超声波清洗器：KQ-250DB 型，昆山市超声仪器有限公司。
（5） 高纯度氮气发生器：SPN-300 型，北京中惠普分析技术研究所。
（6） 高纯度氢气发生器：SPH-300 型，北京中惠普分析技术研究所。
（7） 全自动空气源：SPB-3 型，北京中惠普分析技术研究所。
1.1.2 主要试剂
（1） 氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂。
（2） 三氯丙酮：中国食品药品检验研究院。
（3） 叶酸：河北冀衡药业股份有限公司。
1.2 色谱条件
（1） 检测器：FID 检测器。
（2） 检测器温度：250 ℃。
（3） 进样口温度：200 ℃。（4） 色谱柱温度：150 ℃
（5） 毛细管色谱柱：ov-1(相当于HPI 柱)，30 m×0.53 mm×3.0 um。
（6） 载气：氮气。
（7） 载气流速：1 mL/min。
（8） 分流比：1∶1。
（9） 进样量：1 μL，自动进样。
（10） 量程：1。
1.3 溶液配置
1.3.1 对照溶液的配置
（1） 精密称取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，测定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠溶液，稀释至刻度，作为三氯丙酮储备液。
（2） 精密量取1.0 mL 储备液于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠溶液，稀释至刻度，摇匀，作为三氯丙酮对照溶液。
1.3.2 供试品溶液的配置
（1） 精密称取0.2 g 叶酸样品于10 mL 容量瓶中。
（2） 再加入0.1%氢氧化钠溶液，稀释至刻度，摇匀，备用。
1.4 计算方法
分别吸取1 μL 对照品溶液和供试品溶液分别注入至气相色谱仪中，对照品溶液进5 针，供试品溶液进平行样各进一针，按外标法计算三氯丙酮的含量。
计算公式如下：
式中：As 为供试液图谱中三氯丙酮的峰面积，mAu；Ar 为标准溶液图谱中三氯丙酮的峰面积，mAu；Ws 为称取样品的质量，g；Wr 为配制标准溶液称取三氯丙酮的质量，g。
2 结果与讨论
2.1 检测方法的专属性
（1） 精密称取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，测定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠溶液，稀释至刻度，作为三氯丙酮储备液。
（2） 精密量取1.0 mL 储备液于100 mL 容量瓶中，加入0.1%氢氧化钠溶液至刻度，摇匀，作为三氯丙酮对照溶液。
（4） 精密吸取1 mL 0.1%氢氧化钠溶液于样品瓶中，密封，作为空白溶液。
（5） 将分别量取的1 μL 对照溶液和空白溶液注入到气相色谱仪中。
从空白溶液色谱图中，未检测到三氯丙酮，检测结果表明无其他色谱杂峰，对叶酸残留溶剂三氯丙酮含量的测定无明显干扰，证明该方法专属性良好。
2.2 检测方法的线性关系
（1） 精密称取0.5 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，测定值：80%） 加入至100mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠，稀释至刻度，作为三氯丙酮储备液。
（2） 精密量取1.0 mL 储备液于100 mL 容量瓶中，加入0.1%氢氧化钠至刻度，摇匀，作为三氯丙酮对照溶液。
（3） 自三氯丙酮的定量限至限度的150%，分别稀释成浓度为10、30、50、70、90、110 ug/mL 6 个三氯丙酮的标准品溶液，并依次编号。
（4） 取上述各浓度的溶液1 μL，按照1.2 色谱条件，注入气相色谱仪中，记录色谱图并计算峰面积。
（5） 将得出的数据以峰面积为纵坐标，以三氯丙酮溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
不同浓度的三氯丙酮标准品溶液的峰面积见表1。
表1 不同浓度的三氯丙酮标准品溶液的峰面积Table 1 Peak area of standard solutions of trichloroacetone at different concentrations
三氯丙酮溶液的标准曲线如图1 所示。
图1 三氯丙酮溶液线性关系Fig.1 Linear relationship of trichloroacetone solution
由图1 可以看出，在0.148 8～111.600 0 ug/ml浓度范围内，具有良好的线性关系，相关系数R2=0.999 8，线性方程为y=8 058.5x+5 790.6。
2.3 方法的定量限和检测限
取对照品溶液逐级稀释，测定，以信噪比约为10 作为定量限，以信噪比约为3 作为检测限，计算得出三氯丙酮的定量限为0.02 ug/ml，检测限为0.079 ug/ml。
2.4 对照溶液的精密度实验
（1） 精密称取0.5g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，测定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠，并稀至刻度作为三氯丙酮储备液。
（2） 精密量取1.0 mL 储备液于100 mL 容量瓶，再加入0.1%氢氧化钠至刻度，摇匀，配制成三氯丙酮标准品50 ug/mL 的溶液。
（3） 取上述溶液1 μL，按照1.2 色谱条件，注入气相色谱仪中，连续进样6 针。
三氯丙酮对照溶液的精密度实验结果见表2。
表2 三氯丙酮对照溶液精密度实验结果Table 2 Precision experimental results of trichloroacetone control solution
由表2 可以看出，检测结果的重复性良好，各峰面积RSD＜5.0%，符合分析方法学的要求。
2.5 考察对照溶液的稳定性
（1） 精密称取0.500 0 g 三氯丙酮（F4B3J-LJ，测定值：80%） 于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠，稀释至刻度，作为三氯丙酮储备液。
（2） 精密量取1.0 mL 储备液于100 mL 容量瓶中，再加入0.1%氢氧化钠至刻度，摇匀，配制成三氯丙酮标准品50 ug/mL 的溶液。
（3） 分别于0、2、4、8、12、18、24 h 取上述溶液各1 μl，按照1.2 色谱条件，注入气相色谱仪中，记录色谱图。
三氯丙酮对照溶液的稳定性结果见表3。
表3 三氯丙酮对照溶液的稳定性结果Table 3 Stability results of trichloroacetone control solution
由表3 可以看出，与0 h 相比，24 h 对照品溶液稳定，峰面积RSD＜5%，符合方法学的要求。
2.6 对照溶液耐用性考察
精密量取三氯丙酮对照品溶液1 uL，设置不同的流速为0.8、1.0、1.2 mL/min、进样口温度分别为198、200、202 ℃，检测器温度分别为248、250、252 ℃，测定各条件下系统的耐用性。
三氯丙酮的耐用性实验结果见表4。
表4 三氯丙酮的耐用性实验结果Table 4 Durability test results of trichloroacetone
2.7 叶酸样品的测定
按照1.3 溶液的配制标准，取3 批叶酸原料药分别进行有关残留溶剂三氯丙酮的检测，叶酸样品中残留溶剂的实验结果见表5。
表5 叶酸样品中残留溶剂的含量Table 5 Content of residual solvents in folic acid samples
由表5 可以看出，叶酸原料药中无三氯丙酮残留。
3 结 语
建立的定量分析叶酸中的残留溶剂三氯丙酮的气相色谱法，具有操作简单、耗时短、误差小等优点。使用0.1%氢氧化钠作溶剂，检验叶酸中残留溶剂三氯丙酮，结果表明，三氯丙酮浓度在0.148 8～111.600 0 ug/mL 之间具有良好的线性关系，相关系数R2=0.999 8，相对标准偏差RSD＜5%。通过方法学验证，该方法精密、准确、检测性良好。因此，气相色谱法可以准确测量叶酸原料药中残留溶剂三氯丙酮的含量。
