酸性蛋白复合酶提取大枣多糖方法研究

郑静美，闫婧怡，王军华，王 蓓，孙博研

（河北瑞龙生物科技有限公司，河北 石家庄 050000）

0 引 言

枣为蔷薇目鼠李科枣属植物，在中国已有长达8000 多年的种植历史，被列为“五果”之一，枣中富含多糖、蛋白质、脂肪、糖类、胡萝卜素、维生素等营养成分，现已广泛种植。近年来我国对多糖在医药领域中的应用研究很快，研究范围广，涉及理化性质、应用等。大枣多糖结构复杂，具有重要的生理保健功能和生物活性，可有效的清除体内的自由基，具有抗衰老、抗癌症、抗病毒等多种生理活性。

对于大枣多糖的提取研究较多,包括传统的水提法、溶剂萃取法等，均存在一些问题，水提法由于温度较高会导致大枣多糖活性变差，且需要多次反复操作，需要较长的操作周期，溶剂萃取法虽应用广泛，但每次提取均需新鲜溶剂用于提供较大的溶解能力，每次循环时间长，不适于高沸点溶剂，且存在溶剂回收难、有残留等问题。随着科学技术的发展，近年来也出现了一些新的提取方法和设备，包括：超临界CO2萃取、分子筛分离法，膜分离集成技术等，但存在设备成本高等缺点。目前，有研究采用酶法提取大枣多糖。酶制剂的品种繁多，且功效不一，由于酶制剂具有专一性、催化效率高，不发生副反应，且不需要高温、高压、强酸、强碱等条件，反应温和，且反应产物无毒。针对大枣多糖细胞壁厚、细胞粗大，且含有一定量的蛋白质的情况，需有针对性的选取合适的酶制剂，加速大枣多糖从细胞中的扩散速率，缩短大枣多糖的提取时间。石奇等人研究了中性蛋白酶提取大枣多糖，杨辉等人研究了果胶酶提取大枣多糖的工艺。本研究选用复合酶做为提取大枣多糖的酶制剂，相较于单一的酶制剂减低了成本，并能发挥复合酶的协同作用。通过对酶制剂的筛选，确定了酸性蛋白复合酶做为大枣多糖提取的酶制剂，并通过单因素试验及正交试验优化了酸性蛋白复合酶液提取大枣多糖的工艺，为大枣多糖的加工及应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

大枣购于石家庄农贸市场，将大枣筛选后去核、干燥后粉碎，得到干燥枣粉。果胶复合酶液、纤维素复合酶液、酸性蛋白酶液均购自广西南宁东恒华道生物科技有限公司，其中果胶复合酶液中含有少量半纤维素酶及淀粉酶，纤维素复合酶液中含有少量半纤维素酶及果胶酶，酸性蛋白酶液中含有少量果胶酶及淀粉酶。

1.2 试 剂

试验中所用试剂见表1。

表1 试验中所用试剂Table 1 Reagents used in the experiment

1.3 仪器与设备

试验中所用仪器设备见表2。

表2 试验中所用仪器Table 2 Instruments used in the test

1.4 实验方法

1.4.1 复合酶制剂筛选

称量干燥枣粉4 份100 克，分别加入1000g水，分别添加底物浓度为1%的果胶酶复合酶液、1%的酸性蛋白复合酶液、1%的纤维素复合酶液，调节溶液pH，将添加果胶酶复合酶液及纤维素复合酶液的溶液pH 调节至7，将添加酸性蛋白复合酶液的溶液pH 调节至4.2，于40 ℃下提取120 min。离心后取上清液，浓缩，加入无水乙醇进行醇沉，离心后去上清液，将沉淀层多糖进行干燥，干燥后复溶，采用三氯乙酸脱蛋白，向脱蛋白后的溶液中加入双氧水进行脱色反应。脱色后浓缩，醇沉后离心去上清，将沉淀层多糖干燥后得到多糖。实验进行3 次取平均值，筛选出适宜的复合酶制剂。

1.4.2 加酶浓度对大枣多糖提取含量和得率的影响

称量干燥枣粉5 份各100 克，分别加入1000g水，分别添加底物浓度为0.2%、0.5%、1.0%、1.2%、1.5%的酸性蛋白复合酶液，调节溶液pH 值至4.2，于40 摄氏度下提取120min。后续步骤与1.4.1 相同。实验进行3 次取平均值，筛选出适宜的酸性蛋白复合酶添加浓度。

1.4.3 提取时间对大枣多糖提取含量及得率的影响

称量干燥枣粉6 份各100 克，分别加入1000g 水，添加底物浓度为1.0%的酸性蛋白复合酶液。调节溶液pH 值至4.2，溶液温度40℃，提取时间分别设置40min、 60min、 100min、120min、140min、160min。后续步骤与1.4.1 相同。实验进行3 次取平均值，筛选出适宜的提取时间。

1.4.4 提取温度对大枣多糖含量和得率的的影响

称量干燥枣粉5 份各100 克，分别入1000g水，添加底物浓度为1.0%的酸性蛋白复合酶液。调节溶液pH 值为4.2，溶液温度分别设置30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，提取时间120min。后续步骤与1.4.1 相同。实验进行3 次取平均值，筛选出适宜的提取温度。

1.4.5 溶液pH 值对大枣多糖提取含量和得率的影响

称量干燥枣粉5 份各100 克，分别入1000g水，酸性蛋白复合酶液添加量为浓度1%。溶液pH 值分别调节至2.2、3.2、4.2、5.2、7.0，溶液温度50℃，提取时间120min。后续步骤与1.4.1相同。实验进行3 次取平均值，筛选出适宜的反应pH 值。

1.4.6 正交试验设计

根据单因素筛选出的实验结果，利用正交分析法设计酸性蛋白复合酶提取大枣多糖的实验方法，选取pH 值、酶添加量、温度、提取时间作为影响大枣多糖提取优化因素，设计L9(34)正交表，优化工艺参数，评估各单因素对发酵物中李子多酚含量影响的主次作用，确认最佳工艺条件。

自变量选用pH 值、酶添加量、温度、提取时间，分别用A、B、C 和D 表示，用1、2、3 分别代表3 个水平，正交试验因素水平表见表3。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Factor level table of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 不同酶制剂对大枣多糖得率、含量影响

不同复合酶制剂处理后大枣多糖的得率和含量如图1 所示。以去离子水组为参照，采用果胶复合酶液处理后大枣多糖含量均较去离子水组有所下降，经纤维素复合酶、酸性蛋白复合酶液处理后大枣多糖含量均较去离子水组有所增加；采用纤维素复合酶液处理后大枣多糖提取率较去离子水组有所下降，果胶复合酶液、酸性蛋白复合酶液处理后大枣多糖提取率有所增加；以大枣多糖的得率和含量为条件进行综合判定，得出酸性蛋白复合酶液参与提取大枣多糖效果较好。因此，选取酸性蛋白复合酶液用于后续试验。

图1 不同酶制剂对大枣多糖得率、含量影响Fig.1 Effect of different enzyme preparations on the yield and content of jujube polysaccharides

2.2 酸性蛋白复合酶提取大枣多糖单因素试验研究

2.2.1 酸性蛋白复合酶液的添加量对大枣多糖提取含量和得率的影响

酸性蛋白复合酶液的添加量对大枣多糖提取含量和得率的影响如图2 所示，分析不同酸性蛋白复合酶液添加量下大枣多糖得率，可得当其添加量在0.2%～0.5%之间，大枣多糖得率有明显增加，但随着酸性蛋白复合酶液添加量的增加，大枣多糖得率急剧下降，达到1.5%时，得率几乎为零，因此，为了得到较多的大枣多糖，酸性蛋白复合酶液的在添加量为1.0%～1.2%时较为适宜。同时大枣多糖的含量随着酶添加量的增加有所增加，但当添加量超过1.2%以后，大枣多糖含量呈现下降趋势。综合以上实验结论，再结合成本，可以得出，酶制剂的添加量在1.0%～1.2%之间获得的大枣多糖无论是含量还是得率均最佳且成本最低。

图2 酶制剂添加量对多糖含量和多糖得率的影响实验图Fig.2 Experimental diagram of the effect of enzyme addition on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.2 提取时间对大枣多糖提取含量及得率的影响

提取时间对大枣多糖提取含量和得率的影响如图3 所示。随着提取时间的增加，大枣多糖得率呈上升的趋势，且在60 min 时大枣多糖得率增长速率最大。当提取时间超过120 min，大枣多糖得率随着时间变化不明显。随着提取时间的延长，大枣多糖含量也呈上升趋势，但当提取时间超过140 min 后，大枣多糖的含量下降很快。综合大枣多糖得率和含量的试验结果，得出提取时间在120 min左右时最为合适。

图3 提取时间对多糖含量和多糖得率的影响实验图Fig.3 Experimental graph of the effect of extraction time on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.3 提取温度对大枣多糖含量和得率的的影响

提取温度对大枣多糖提取含量和得率的影响如图4 所示。随着提取温度的升高，大枣多糖得率和含量都呈现出上升的趋势，且在50 ℃时，大枣多糖得率和含量的增长速率均最大，50 ℃以后，不论是大枣多糖的含量还是得率都呈现出下降趋势，因此，50 ℃为酸性蛋白复合酶制剂最适宜的反应温度。

图4 提取温度对多糖含量和多糖得率的影响实验图Fig.4 Experimental graph of the effect of extraction temperature on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.2.4 溶液pH 值对大枣多糖提取含量和得率的影响

溶液pH 对大枣多糖提取含量和得率的影响如图5 所示，当溶液pH 在2.2-3.2 之间时，大枣多糖得率和含量都呈上升的趋势，当溶液pH 值超过3.2 后，大枣多糖得率和含量都呈下降的趋势，因此，当溶液pH 为3.2 时为酸性蛋白复合酶液最佳反应pH。

图5 溶液pH对多糖含量和多糖得率的影响实验图Fig.5 Experimental graph of the effect of solution pH on polysaccharide content and polysaccharide yield

2.3 酸性蛋白复合酶提取大枣最佳提取条件正交试验

根据试验设计得出的试验结果见表4。

表4 正交试验设计与数据分析Table 4 Orthogonal experimental design and data analysis

通过表4 的正交试验结果，综合大枣多糖含量及多糖得率综合评估，可以得出酸性蛋白复合酶液提取大枣多糖最佳工艺条件是：酸性蛋白复合酶液的添加量为1.0%，反应温度40℃，溶液pH 值为3.2，提取时间为120min，在此条件下，大枣多糖的含量为41.93%，得率为4.9%。

3 结 语

本研究以大枣做为试验原料，充分利用生物酶技术，通过添加复合酶制剂有效分解大枣组织，加速大枣多糖释放，提高提取率，保证大枣多糖提取率及得率的最大化地的同时不破坏大枣多糖的生物活性；充分总结传统大枣多糖的提取利用单一酶源成本高、提取率低、不适宜大规模工艺生产的弊端，通过比较果胶酶复合酶液、酸性蛋白复合酶液及纤维素复合酶液，筛选出适宜大枣多糖提取的酸性蛋白复合酶液做为大枣多糖提取的酶制剂，利用单因素试验，通过优化酸性蛋白复合酶液的添加量、反应时间、反应温度及溶液pH 提高酸性蛋白复合酶液提取大枣多糖的含量，进一步通过正交试验优化反应结果,得到了酸性蛋白复合酶液提取大枣多糖的最佳工艺条件：在40℃的条件下，调节溶液pH 至3.2，酸性蛋白的添加量为1%，在此条件下提取2 h 后，大枣多糖的含量可达41.93%，得率可达4.9%。