酶联免疫吸附试验在兽药残留检测应用中的体会

2023-08-08李汉中

河北农业 2023年4期

□文/李汉中

酶联免疫吸附试验（ELISA）是当前应用广泛的一项定性/半定量检测抗体（抗原）的免疫酶检测技术。其基本原理是利用抗原抗体的特异性结合，将待测物质（违禁物或兽药小分子）作为抗原与其特异性抗体反应，再利用酶的高效催化性将此反应效果放大，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，存在一定的线性相关关系，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。目前，已广泛应用于兽药残留检测、生物毒素检测、农药残留检测、微生物检测、转基因产品检测等多个领域。

ELISA 作为一种快速检测方法由于其操作简单，能得到定量检测结果，广泛应用于兽药残留检测领域。与我们生活息息相关的肉、蛋、奶以及常见的水产品如鱼，虾中的违禁药物，像大家熟知的“瘦肉精”“苏丹红”“三聚氰胺”“黄曲霉M1”以及常见的抗生素都有技术成熟的试剂盒。

本人从事兽药残留检测多年，发现关于ELISA 的科学研究方面的文章比较多，本文着重讨论多年来使用ELISA 检测试剂盒进行兽药残留检测的经验和教训，以期与各检测单位一线工作者分享。

一、酶联免疫吸附试验的地位

酶联免疫吸附试验自20 世纪70 年代问世以来经过了近几十年的快速发展，已广泛应用于各个领域。虽然其有假阳性率高、反应过程对外界环境要求较高、反应时间较长（相对于胶体金快检卡而言）等缺点，但由于其费用低廉、前处理简单、仪器设备便于操作、结果定量化、安全性好、污染小，在今后相当长的一段时间内仍会在相关企业、基层检测机构扮演重要角色。

二、影响酶联免疫吸附试验结果的几个方面

（一）酶联免疫检测试剂盒的选择

由于酶联免疫吸附试验的原理，因此不同企业生产的抗体的特异性，稳定性的好坏对整个试剂盒的检测结果影响较大。结合本人多年以来的工作经验而言，采购试剂盒时一定要慎重选择其生产企业，要购买那些技术研发实力雄厚的企业的产品，建议可参考农业部备案的厂家目录。因其技术水平相对较高，产品相对较稳定。十几年前本人使用过一些不知名企业生产的试剂盒，在使用过程中出现了假阳性率过高，标准曲线不成线性等问题。

（二）酶标仪的选择

酶联免疫吸附试验除了用到检测试剂盒之外，在整个试验过程中还有一个重要的仪器设备那就是酶标仪。其用来测量加完终止液后酶标孔中液体的吸光度。利用其中某种物质含量与其吸光度之间的函数关系，来反推待测物浓度，因此不同厂家、不同型号之间的质量也存在差异，在选购之前要认真考虑。

（三）酶联免疫检测试剂盒使用过程中需要注意的问题

1.样品的前处理

一般来讲酶联免疫吸附试剂盒中待检样品的前处理需要经过样品称量、目标物提取等步骤。具体操作就是在称量好的样品中加入某种试剂，振荡混匀，然后离心，离心后有的直接取上清液若干量，再加上复溶工作液若干量，混匀后即可用于检测；有的上清液需要再50～60℃氮气吹干后，加入一定量的正己烷，混匀一定时间，再加入一定量的复溶工作液，混匀、振荡、离心后取下层水相直接用于检测。本人认为在这些环节中，样品的称量很关键，首先要根据称量准确选择精确度符合要求的天平。其次振荡、离心这两个环节对试验结果也有影响，要认真规范操作，不可随意缩短振荡时间。

2.点板过程

酶联免疫吸附试验最主要的试验操作就是点板，即使用单道移液器或多道移液器向试剂盒的96孔板的U 型孔中添加各种试剂。因此能否正确使用此器具对试验结果是否准确至关重要。怎么保证其正确使用呢？首先，如果条件允许，最好定期找有资质的机构对其进行检定或校准，保证其自身质量没问题。如果条件不允许可在使用前使用纯水，电子天平，自检一下使其风险可控。其次要会正确使用。其常规的使用方法为“吸一打二”。其中的“一二”指的是移液器控制按钮下压的两个档位，下压遇到阻力时为第1 档，继续加大力度压至按不动为第2 档，所谓的“吸一打二”就是指吸取液体的时候，用拇指按住顶端的控制按钮至第1 档，而向外释放液体的时候用拇指按住顶端的控制按钮至按不动为止。后来又有人提出了“吸二打一”的使用方法。要注意的是实际操作时，如果将移液器调至一固定量程，需要反复多吸几次，只有在第一次吸取时是“吸二打一”，此后再吸再打时均是“吸一打一”。在这里还有一点需要注意，就是“吸二打一”的量程不能超过移液器的最大量程。举例说明，如果移液器的量程为20～200 微升，如果采用“吸二打一”的吸取方式，最好吸取量不要超过100微升。因此洗板时不能采用“吸二打一”。个人认为无论是“吸一打二”还是“吸二打一”只要操作规范都可以准确量取。切忌使用过程中吸打动作太快，这样容易引起吸取液体时，因为有气泡可能导致液体接触到移液器的头部，污染液体，或释放液体时太快，液体溅到目标U 型孔外面，影响试验结果。当吸取黏性较大，泡沫较多浓度较小的目标液时如酶标二抗工作液，抗体工作液、低浓度的标准品时可以考虑采用“吸二打一”的操作。当吸取黏性较小的目标液体时，如底物A、底物B、动物尿液样本，可以采用“吸一打二”的操作。因为整个试验过程不可避免的要使用八道移液器，在此着重说一下八道移液器使用的注意事项。八道移液器使用过程中首先要确定每一个枪头都安装到位，拧紧了，其次要保证使用过程中枪头要垂直悬空于目标微孔之上，尽量不要接触微孔壁，再次一定要注意使用过程中观察八个枪头中的液面高度是否一致，如若差别太大，则证明吸量不准确，就会影响试验结果，尤其是量取酶标二抗和抗体工作液以及洗板时要注意。

3.其他可能影响试验结果的方面

整个检测试剂盒内的试剂，提前包被好抗原或抗体的96孔板，包括处理好的待检样品在点板之前一定要回复至室温，实践证明检测过程中的环境温度对结果影响较大，温度不宜过低。所有试剂尤其是各个浓度的标准品、酶标二抗、抗体工作液、底物A、底物B 在使用前一定要混匀，混匀动作不可太粗暴，摇晃不可太剧烈，否则会产生大量气泡，影响结果。

整个实验过程一定要认真按照说明书的要求操作，不能靠记忆去操作。因为虽然原理一样，但由于不同检测项目用到的ELISA 有直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA 等区别，所以在点板过程中会存在一些差异，如酶标二抗和抗体工作液的添加顺序，酶标二抗工作液的配制，底物A、底物B 的添加顺序添加量，洗板次数，避光反应时间长短等。