基于TLR4/MAPK信号通路探讨柚皮素对类风湿关节炎大鼠的治疗作用

黄浦洋 江强 黄巧霞 符圣亮 王聪

(儋州市人民医院肾病风湿科,海南 儋州 571700)

类风湿关节炎(RA)是一种炎症性疾病,其特征是炎症细胞渗透到滑液中,导致滑膜、关节软骨和关节骨骼变性〔1,2〕。由于久坐的生活方式和对RA的认识不足,中国RA(尤其是女性)的患病率正在增加〔3〕。Toll样受体(TLR)4是一种非特异性免疫的蛋白质分子,其可调控下游因子丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)参与病理生理过程中的炎症反应。Huang等〔4〕研究显示,抑制TLR4/MAPK信号通路表达可减轻急性肺损伤小鼠肺组织的炎症反应。Wu等〔5〕研究报道,TLR4/MAPK通路下调可减轻四氯化碳诱导的小鼠肝脏炎症反应,减少病原菌。柚皮素是一种二氢黄酮类化合物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用〔6〕。有研究报道,柚皮素可减轻丙烯酰胺肾毒性大鼠肾组织氧化应激和炎症反应,改善肾组织细胞凋亡,从而保护大鼠肾功能〔7〕。Wang等〔8〕研究表明,柚皮素可改善单侧输尿管梗阻大鼠肾组织病理结构,降低炎症因子表达,从而发挥抗肾间质纤维化的作用。但柚皮素是否对RA有治疗作用尚未有研究。故本研究拟通过TLR4/MAPK信号通路探究柚皮素对RA大鼠的作用效果,以期为RA的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1动物 雄性SD大鼠(清洁级,10周龄,体质量247～270 g),购自昆明医科大学实验动物中心,生产许可证号:SCXK(云)2021-0002。在自然通风、12 h明暗循环、(26±2)℃环境中饲养1 w。本研究经儋州市人民医院伦理委员会批准。

1.2主要药物、试剂和仪器 柚皮素(批号480-41-1,原料药,纯度99.98%,上海纯优生物科技有限公司);甲氨蝶呤片(批号20211209,吉林省通化茂祥制药有限公司);牛Ⅱ型胶原液体、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)盒、TRIzol试剂、蛋白提取试剂盒、羊抗鼠二抗(批号分别为JK56958S、JK52147S、JK25968S、JK48968S、JK20159S、JK90157、JK20671,北京中生瑞泰科技有限公司);白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒、苏木素-伊红(HE)染色剂、MAPK单克隆抗体(批号分别为M-19152、M-19131、M-50174,北京金道欣生物技术有限公司);IL-1β ELISA试剂盒、聚合酶链反应(PCR)试剂盒、TLR4单克隆抗体、β-actin单克隆抗体(批号分别为21-1712、21-19143、21-06072、22-09124,武汉诺见生物技术有限公司);酶标仪、显微镜(型号分别为Synergy H4、MWP-101,上海然哲仪器设备有限公司);荧光定量PCR仪(型号Q380,上海实维实验仪器技术有限公司);化学发光图像分析仪(型号ChampChemi 610,南京世研仪器设备有限公司)。

1.3动物建模、分组及给药 根据文献〔9〕中的方法进行RA大鼠造模:将浓度为2 mg/ml的牛Ⅱ型胶原液体与完全弗氏佐剂按等比例混合成混悬液A,与不完全弗氏佐剂按等比例混合成混悬液B。采用乙醚麻醉大鼠后,第1天从尾根部注射混悬液A 0.1 ml,第7天从尾根部注射混悬液B 0.1 ml,第14天观察到大鼠踝关节明显红肿且体积增大,则表明造模成功〔9〕。成功造模56只大鼠,随机分成模型组、甲氨蝶呤组(1 mg/kg)〔10〕、柚皮素低剂量组(50 mg/kg)、柚皮素高剂量组(100 mg/kg)〔11〕,每组14只。另取14只健康大鼠分别于第1天和第7天尾根部各注射0.1 ml生理盐水设为对照组。造模成功后,甲氨蝶呤组、柚皮素低、高剂量组分别灌胃1 mg/kg的甲氨蝶呤、50、100 mg/kg的柚皮素(浓度分别为0.1 mg/ml的甲氨蝶呤混悬液、5、10 mg/ml的柚皮素混悬液,灌胃体积10 ml/kg);模型组和对照组灌胃10 ml/kg的生理盐水,1次/d,连续给药4 w。

1.4关节肿胀度检测 分别于造模前、给药结束后第1天,采用足趾容积测量仪测量大鼠左侧后足爪体积,方法如下:以大鼠左侧后足踝关节上0.8 cm为基准,将0.8 cm以下的部位全部浸没在水槽中,读取大鼠左侧后足体积(取测量5次的平均值),计算关节肿胀度〔关节肿胀度=(给药结束后第1天体积值-造模前体积值)/造模前体积值×100%〕。

1.5关节肿胀评分 分别于造模成功后第1天、给药结束后第1天对大鼠双侧后足爪关节肿胀进行评分,标准如下〔12〕:正常无红肿计0分;趾关节红肿计1分;足趾和趾关节肿胀计2分;踝关节以下部位肿胀发红计3分;整只足爪肿胀计4分。统计两只后足爪肿胀情况,将两只后足爪评分之和计为总评分,最高为8分,得分越高表示肿胀程度越严重。

1.6血清炎性指标检测 于给药结束后第1天用戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉取血3 ml,分离血清,采用ELISA检测血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平。

1.7踝关节组织病理观察 断头处死大鼠,获取右侧后足踝关节组织,清洗后经乙二胺四乙酸脱钙,石蜡包埋、切片(4 μm厚),HE染色后显微镜观察病理变化。

1.8踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达检测 取右侧后足踝关节滑膜组织,将其匀浆,利用TRIzol试剂提取滑膜组织中总RNA,逆转录合成cDNA,在荧光定量PCR仪上进行反应。PCR条件如下:95 ℃持续48 s,42个循环(95 ℃持续5 s,60 ℃持续34 s,73 ℃持续21 s),引物由北京龙跃生物科技发展有限公司合成。序列如下:TLR4上游引物:5′-CACACCCCAGCCATGTACG-3′,下游5′-ATGTCACGCACGATTTCAC-3′;MAPK上游引物:5′-TGTCCAGAATTGCAGGTCTTTG-3′,下游:5′-ATCCCGCTTAAGAATAGGTAGGT-3′;β-actin上游引物:5′-AAGGAGGTGGCTATGACAGAG-3′,下游:5′-GTGAGTGCGTTAGGCCCAT-3′。以2-ΔΔCt法计算TLR4、MAPK mRNA表达水平。

1.9踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达检测 取1.8中匀浆的踝关节滑膜组织,蛋白提取试剂盒提取滑膜组织中的总蛋白,进行蛋白浓度定量后,上样100 μg总蛋白进行电泳和转膜操作,12%脱脂奶封闭膜3 h,加入TLR4(1∶700)、MAPK(1∶900)、β-actin(1∶1 100)单克隆抗体,在5 ℃环境下孵育24 h,洗膜后添加羊抗鼠二抗(1∶2 100)于26 ℃孵育4.5 h,增强型化学发光图像分析仪对蛋白条带进行可视化,并使用Image-Pro Plus软件对蛋白表达进行定量。

1.10统计学分析 采用SPSS24.0软件进行数据处理,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较行SNK-q检验。

2 结 果

2.1柚皮素对关节肿胀度和关节肿胀评分的影响 与对照组比较,模型组关节肿胀度和关节肿胀评分显著升高(P<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组、柚皮素低、高剂量组关节肿胀度和关节肿胀评分显著降低(P<0.05);柚皮素高剂量组关节肿胀度和关节肿胀评分显著低于柚皮素低剂量组(P<0.05);甲氨蝶呤组和柚皮素高剂量组关节肿胀度和关节肿胀评分差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组关节肿胀度和关节肿胀评分、血清TNF-α、IL-6、IL-1β比较

2.2柚皮素对血清炎性指标的影响 与对照组比较,模型组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组、柚皮素低、高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低(P<0.05);柚皮素高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著低于柚皮素低剂量组(P<0.05);甲氨蝶呤组和柚皮素高剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3柚皮素对踝关节组织病理的影响 对照组踝关节表现出正常的关节软骨结构,没有中性粒细胞浸润;模型组踝关节软骨层明显增厚,表现出弥漫性中性粒细胞浸润,关节软骨侵蚀和滑膜炎(箭头所示);甲氨蝶呤组及柚皮素高剂量组踝关节结构完整,无中性粒细胞浸润和炎症表现;柚皮素低剂量组踝关节具有少量炎症细胞浸润(箭头所示),软骨结构疏松紊乱。见图1。

图1 各组踝关节组织病理结构(HE染色,×200)

2.4柚皮素对踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达的影响 与对照组比较,模型组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组、柚皮素低、高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达水平显著降低(P<0.05);柚皮素高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达水平显著低于柚皮素低剂量组(P<0.05);甲氨蝶呤组和柚皮素高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA及蛋白表达水平比较

2.5柚皮素对踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达影响 与对照组比较,模型组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,甲氨蝶呤组、柚皮素低、高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达水平显著降低(P<0.05);柚皮素高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达水平显著低于柚皮素低剂量组(P<0.05);甲氨蝶呤组和柚皮素高剂量组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。

1～5:对照组、模型组、甲氨蝶呤组、柚皮素低剂量组、柚皮素高剂量组图2 各组踝关节滑膜组织TLR4、MAPK蛋白表达

3 讨 论

RA是一种自身免疫性关节疾病,其特征是滑膜炎症和增生、关节软骨退化和结构性骨侵蚀,导致进行性残疾。有证据表明,RA的发病机制涉及多种免疫、环境和遗传因素〔13〕。但是该疾病严重程度及炎性和破坏性介质表达增加的根本原因仍然未知。RA的当前治疗策略包括使用非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药及使用皮质类固醇和抑制主要促炎细胞因子合成的生物化合物。这些药物可长期缓解RA症状,但在治疗中断后,仍可导致疾病复发〔14〕。疾病复发是治疗RA的潜在障碍之一,为了在RA治疗中获得更多益处,需要开发新药以获得长期缓解。

柚皮素具有优秀的抗风湿、抗炎作用。Zhang等〔15〕研究发现,柚皮素可通过减少炎症细胞浸润和滑膜损伤,有效改善RA大鼠治疗效果。Hua等〔16〕研究表明,柚皮素可改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠代谢参数,抑制肝脂肪变性,减少肝纤维化和细胞衰老,抑制肝脏炎症。Yang等〔17〕发现,柚皮素可降低多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织炎症,改善氧化微环境和胰岛素抵抗,发挥对多囊卵巢综合征的治疗作用。本研究表明,柚皮素可改善RA大鼠关节肿胀和踝关节病理状况,抑制炎症反应,与上述研究结果一致。

TLR4/MAPK信号通路是炎症和各种免疫疾病发展中的关键角色。Li等〔18〕研究发现,抑制TLR4/MAPK信号通路可减轻脂多糖诱导的脓毒症大鼠炎症反应,提高大鼠存活率。Hassanein等〔19〕研究表明,反式阿魏酸可抑制TLR4/MAPK炎症信号通路,减轻顺铂诱导的睾丸损伤大鼠睾丸组织氧化应激过程,增强其体外细胞抗毒活性,对顺铂诱导的睾丸损伤显示出潜在的保护作用。Li等〔20〕报道,抑制TLR4/MAPK通路可减轻RA大鼠症状(如肿胀、发红和滑膜炎),降低关节炎指数评分,并下调血清IL-6、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1和TNF-α等促炎细胞因子水平。本研究表明,柚皮素可抑制RA大鼠踝关节滑膜组织中TLR4/MAPK信号通路表达。研究发现,TLR4信号通路可影响重症急性胰腺炎患者血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平,TLR4信号通路活性与TNF-α、IL-1β和IL-6呈正相关〔21〕。结合本研究结果,推测柚皮素对RA大鼠的治疗作用,可能与其抑制TLR4/MAPK信号通路激活有关。

综上所述,柚皮素对RA大鼠的治疗作用明显,可改善RA大鼠关节肿胀和踝关节病理状况,抑制炎症反应,其机制可能与柚皮素抑制RA大鼠踝关节滑膜组织TLR4、MAPK mRNA和蛋白的表达进而抑制TLR4/MAPK信号通路的激活有关。