氮磷钾配施对植烟土壤速效养分和真菌多样性的影响

李航 苏梦迪 黄浪平 马啸 王欢欢 敖飞 胡丽涛 张松涛

（1 河南农业大学烟草学院/烟草行业烟草栽培重点实验室，450002，河南郑州；2 中国烟草总公司重庆市公司丰都分公司，408200，重庆）

土壤微生物种类繁多、数量巨大、代谢活动频繁，微生物群落被视为土壤生态系统健康和恢复土壤功能水平的指标[1-2]。根际是植物、土壤及微生物相互作用的中心，土壤中的氮、磷、钾等有效养分通过根际被烟草吸收，因而土壤微生物在改善土壤结构、维持土壤养分和拮抗病害等方面起着重要作用[3-5]。土壤真菌是土壤微生物的重要组成之一，在土壤的营养循环、有机质的形成分解和肥力改善等方面作用显著，作为自然界的分解者，真菌比细菌能更好地降解复杂化合物[6-8]。因此，根际土壤真菌在一定程度上可以体现土壤速效养分和环境质量状况。

氮、磷和钾肥的施用是保障烟叶产质量的重要农业措施，其能通过改变土壤养分含量影响参与土壤养分循环的真菌多样性[9-11]。氮肥是影响真菌群落的敏感因子，能够显著影响土壤中真菌多样性，改变真菌群落结构，与土壤pH 相比，土壤养分对真菌影响较大[12-15]。关于磷肥和钾肥对作物产质量影响等方面的研究较多，而对土壤微生物多样性影响的研究较少。磷肥是影响灰牧草根际微生物的主要因素[16]，磷钾肥配施可以改变菌群结构，显著降低丛枝菌根真菌的数量和多样性[17]。此外，土壤中的铵态氮向硝态氮转化时会产生大量的H+，使得微生物由细菌主导过渡到真菌主导[18]。

随着分子生物学技术和高通量测序技术的迅速发展，土壤微生态的研究逐渐深入。氮、磷、钾是烟草生长发育的关键影响因子，目前，关于氮磷钾对烟草的影响报道较多，但其对植烟土壤根际微生物多样性的影响尚不明确。因此，本研究通过研究不同氮磷钾配施对植烟土壤速效养分和烟草根际土壤真菌多样性的影响，明确氮磷钾对土壤真菌群落的影响机制，为通过调控土壤速效养分和真菌多样性提高作物产量和质量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2020 年在重庆市丰都县太平坝乡开展，该地肥力中等，地形平坦，气候温和、雨热同期，年降水量在1000mm 以上。供试土壤的基本理化性质为碱解氮 168mg/kg 、速效磷57.5mg/kg、速效钾373mg/kg、pH 5.2。

1.2 试验材料

供试单质肥料为硝酸铵（含N 35%）、重过磷酸钙（含P2O543%）和硫酸钾（含K2O 50%）。供试烟草品种为当地主栽品种云烟116（Nicotiana tabacumL.cv.Yunyan116）。

1.3 试验设计

采用随机区组设计，设置5 个处理，分别为CK（不施肥）、NPK（氮磷钾）、PK（磷钾）、NK（氮钾）和NP（氮磷）。NPK 处理供氮、磷和钾量分别为111.00、105.75 和374.55kg/hm2。不同施肥处理肥料用量如表1 所示，各处理不使用其他肥料，每个处理3 次重复，小区随机排列，设置保护行。株距和行距分别为0.5 和1.2m（约15 810 株/hm2），小区面积66.7m2。除施肥外，各小区其他田间管理措施相同。

表1 不同施肥处理肥料用量Table 1 Fertilizer dosage for different fertilization treatments kg/hm2

1.4 土壤样品的采集与测定

移栽后30、60 和90d 分别是烟草的伸根期、旺长期和成熟期的关键节点，也是烟草干物质积累和养分吸收的关键节点。分别于移栽后30、60和90d 采样，每个处理随机选取长势均匀一致的烟株，在不破坏根系的前提下将烟株根部及其附近土壤用铲子完整挖出，用抖根法[19]轻轻抖落烟草根部周围的土壤，装入自封袋，-80℃冰箱保存。收集时注意去除表层0～5cm 的土壤、石块和动植物残体。

采集2 株中间位置宽5cm、深0～20cm 的土壤样品，晾干后磨碎，过20 目筛，封入自封袋待测。按照鲍士旦[20]的方法测定土壤理化性质，采用碱解扩散法测定碱解氮含量，采用碳酸氢钠比色法测定速效磷含量，采用醋酸铵-火焰光度计法测定速效钾含量，采用pH 计测定pH。

1.5 土壤DNA 提取、扩增与高通量测序

采用DNA 试剂盒提取土壤样品DNA，使用NanoDrop2000 检测其浓度。以提取的DNA 为模板，使用真菌ITS 多样性鉴定引物[21]（F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；R：5'-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3'）进行PCR 扩增。由上海欧易生物技术有限公司完成Miseq 文库构建，测序平台为Illumina Miseq。测序数据预处理后使用Vsearch（version 2.4.2）软件[22]按照97%相似度进行OTU 分类，采用Blast 软件[23]和Unite 数据库进行数据的比对和注释。

1.6 数据处理

使用欧易生物云平台和WPS 进行数据分析，使用DPS 7.05 软件进行方差分析，采用最小显著差数法（LSD）进行差异显著性检验（P＜0.05），使用Origin 软件进行冗余分析。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对土壤速效养分的影响

如表2 所示，在移栽后30 和60d，不同施肥处理对土壤速效养分影响差异显著。在移栽后30d，施肥处理降低了土壤的pH，尤其是NPK 处理。NK 处理碱解氮含量比CK 和NPK 处理显著增加，PK 处理则显著增加了速效磷和速效钾含量。在移栽后60d，施肥处理，尤其是NK 和NP处理的土壤pH 显著降低，NP、NK 和PK 处理的碱解氮含量显著低于CK 和NPK 处理，NP 处理的土壤速效磷含量显著增加，NK、PK 和NPK 处理显著增加了土壤速效钾含量。在移栽后90d，不同施肥处理对土壤碱解氮、速效磷和pH 无显著影响，而NPK 和PK 处理的土壤速效钾含量显著增加。结果表明，不同施肥处理在移栽后30 和60d对土壤速效养分影响较大，而在移栽后90d 影响较小。

表2 不同施肥处理对土壤速效养分的影响Table 2 Effects of different fertilization treatments on soil nutrients

2.2 测序数据和真菌α多样性分析

采用Illumina MiSeq 测序平台对45 个土壤样品进行测序，共获得有效序列3 247 007 条，按97%相似度进行OTU 分类，共获得4737 个OTU。物种累积曲线随测序数量的增加由急剧升高变为趋于平坦（图1），平均测序覆盖度达99%以上（表3），说明抽取的样本包含大部分微生物，测序数据合理可靠。

图1 物种累积曲线Fig.1 Species accumulation curve

表3 不同施肥处理真菌群落α指数Table 3 Alpha index of fungal community in different fertilization treatments

如表3 所示，不同施肥处理对土壤真菌丰富度和多样性影响程度不同。移栽后30d，与CK 处理相比，施肥处理降低了真菌的辛普森指数，NK 处理显著降低了真菌的香农指数，而施肥处理对真菌的Chao1 指数和物种数量无显著影响。在移栽后60d，与CK 处理相比，施肥处理对真菌的辛普森指数、香农指数和物种数量无显著影响，PK 处理显著降低了真菌的Chao1 指数。在移栽后90d，不同施肥处理对真菌群落α指数无显著影响。说明施肥处理在移栽后30d 主要影响真菌的多样性，而在移栽后60d 主要影响真菌的丰富度。

2.3 不同施肥处理土壤真菌OTU 分布

如图2 所示，在移栽后30d，NPK、PK、NK、NP 和CK 处理的OTU 数量分别为890、1234、858、1036 和924，特有OTU 数量分别为284、364、157、294 和213，共有OTU 数量为305；在移栽后60d，OTU 数量分别为1211、954、965、1044 和1189，特有OTU 数量分别为334、206、205、233 和294，共有OTU 数量为333；在移栽后90d，OTU 数量分别为1152、1559、1197、1195 和1261，特有OTU数量分别为181、431、230、216 和239，共有OTU数为412。此外，在移栽后3 个时期，施肥处理和CK 特有OTU 数量表现不同。由此可见，不同施肥处理对土壤真菌OTU 数量的影响不同。

图2 不同施肥处理对土壤真菌OTU 影响的韦恩图Fig.2 Venn diagram of effects of different fertilization treatments on soil fungal OTUs

2.4 不同处理土壤真菌群落结构分析

2.4.1 真菌门水平群落结构分析 如图3 所示，物种注释结果表明，45 个土壤样本中真菌在门水平归为8 个门类，包括子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶菌门（ Chytridiomycota ） 、球囊菌门（Glomeromycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）、丝足虫门（ Cercozoa ）和芽枝霉门（Blastocladiomycota）。其中，相对丰度大于1%的优势门类为子囊菌门、接合菌门、担子菌门和壶菌门，其相对丰度之和占所有可注释菌门的84.12%～94.40%。在移栽后30d，不同施肥处理壶菌门相对丰度低于CK，并且施氮处理NP、NK 和NPK 的接合菌门相对丰度均低于不施氮处理PK 和NP。这些结果表明，在移栽后30d，施肥处理能够降低壶菌门真菌的相对丰度，其中施氮处理降低了接合菌门相对丰度。在移栽后60d，不同施肥处理的壶菌门和担子菌门相对丰度均高于CK，而接合菌门相对丰度则均低于CK；施氮处理NPK、NK和NP 处理的子囊菌门均高于不施氮处理PK 和NP。该结果表明，在移栽后60d，施肥处理可以增加壶菌门和担子菌门相对丰度，而降低接合菌门相对丰度，其中施氮处理能够增加子囊菌门相对丰度。在移栽后90d，施肥处理的子囊菌门和担子菌门相对丰度均高于CK，而接合菌门和壶菌门相对丰度均低于CK。以上说明，在移栽后90d 不同施肥处理通过增加子囊菌门和担子菌门、降低接合菌门和壶菌门的相对丰度影响真菌群落结构。

图3 不同处理真菌门水平物种相对丰度（a）和前4 位优势菌门相对丰度（b）Fig.3 Relative abundances of the fungal phylum under different treatments(a)and relative abundances of dominant phyla in top four under different treatments(b)

2.4.2 真菌属水平群落结构分析 如图4 所示，不同施肥处理对土壤真菌群落结构影响较大，相对丰度大于1% 的优势属主要包括腐质霉属（Humicola）、木霉属（Trichoderma）、青霉属（Penicillium）、产油菌属（Solicoccozyma）、油瓶霉属（Lecythophora）、镰刀菌属（Fusarium）和被孢霉属（Mortierella）。在移栽后30d，木霉属相对丰度介于15.50%～53.36%，是绝对优势菌属；施肥处理，尤其是NPK、NK 和NP 处理提高了木霉属和青霉属的相对丰度，降低了镰刀菌属的相对丰度。在移栽后60d，施肥处理提高了木霉属的相对丰度，而施氮处理NPK、NK 和NP 则提高了青霉属的相对丰度。在移栽后90d，施肥处理提高了腐质霉属的相对丰度，降低了木霉属、青霉属和镰刀菌属的相对丰度。可见，不同施肥处理通过提高木霉属和青霉属相对丰度、降低镰刀菌属相对丰度来影响真菌群落结构。

图4 不同处理真菌属水平物种相对丰度（a）和前3 位、第6 位优势菌属相对丰度（b）Fig.4 Relative abundances of the fungal genus under different treatments(a)and relative abundances of dominant fungal genera(Top 1,2,3,6)under different treatments(b)

2.5 土壤真菌群落组成与土壤速效养分的关系

从图5a 中可以看出，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）对真菌优势门水平相对丰度的差异解释度分别为11.58%和88.12%，影响真菌门水平相对丰度的土壤因子依次为速效磷、速效钾、pH 和碱解氮。其中，担子菌门相对丰度与速效磷和速效钾呈正相关，与pH 和碱解氮呈负相关；而子囊菌门和壶菌门相对丰度与碱解氮、速效钾、速效磷和pH 均呈负相关。此外，接合菌门相对丰度与碱解氮、速效钾、速效磷和pH 均呈正相关。如图5b 所示，PC1 和PC2 对真菌优势属水平相对丰度的差异解释度分别为39.14%和57.42%，影响真菌属水平相对丰度的土壤因子依次为碱解氮、速效钾、速效磷和pH。其中，木霉属相对丰度与土壤碱解氮呈正相关，与速效钾、速效磷和pH 均呈负相关，而镰刀菌属相对丰度与速效磷和pH 呈正相关，与碱解氮和速效钾呈负相关。此外，青霉属相对丰度与碱解氮、速效钾、速效磷和pH均呈负相关。由此说明，碱解氮、速效磷、速效钾和pH 等土壤速效养分对真菌群落的影响较大。其中，速效磷和碱解氮是影响丰都县植烟土壤真菌群落结构的主要因素。

图5 土壤真菌优势门和优势属相对丰度与土壤理化因子的RDA 分析Fig.5 Relationship between relative abundance of fungal community at phyluml genus and soil chemical factors by RDA

3 讨论

土壤真菌作为植物根际微生态的重要组成部分，通常会随着环境的变化而改变，通过分解有机质、影响土壤养分转化等维持土壤养分的动态平衡和稳定[24-25]。本研究中，不同施肥处理对土壤速效养分的影响较为显著，尤其是氮肥会降低土壤pH。施用化肥是导致土壤酸化的重要人为因素[26]，施用化肥通过促使肥料或土壤中的NH4+向NO3-转化，释放大量的H+导致土壤pH 降低，这可能是植烟土壤酸化的原因之一[27]。而土壤酸化通过改变真菌群落的结构影响了土壤养分的转化和有效性[28-29]。本研究发现，随着烟草的生长发育，不同施肥处理导致土壤真菌的多样性和群落结构组成发生变化，这可能是由于不同施肥处理降低了土壤pH，进而影响了土壤真菌的多样性和群落结构[30-31]。

不同施肥处理通过改变土壤养分影响真菌群落结构。本研究发现，不同施肥处理能够增加土壤速效磷含量，同时RDA 分析表明，土壤速效磷对子囊菌门和担子菌门相对丰度影响最为显著。土壤速效磷对土壤微生物的影响可能是通过改变土壤pH，进而影响微生物的群落结构[32]。子囊菌门和担子菌门真菌多为腐殖真菌，是根际土壤中养分的关键分解者和常见的优势菌门[33-34]。其中，子囊菌门主要分解难降解的有机质[35]，担子菌门则是木质素和纤维素的分解者，能与植物形成外生菌根[7,36-37]。这些真菌对土壤pH 的改变极为敏感[38-39]，而土壤pH 可能通过影响土壤有机碳、总氮和碳氮比等土壤性质以及调控真菌群落的竞争关系，进而影响真菌群落组成[40-43]。此外，研究发现土壤速效磷和碱解氮的改变影响微生物的群落组成[44]，土壤速效钾影响真菌菌丝对营养的吸收[45]。因此，不同施肥处理通过改变土壤养分影响真菌门水平的群落结构。

在属水平上，木霉属相对丰度与土壤碱解氮呈正相关，与土壤pH 呈负相关，而镰刀菌属相对丰度与土壤pH 呈正相关，与碱解氮呈负相关。木霉属真菌能够抑制植物病原菌，防治多种病害，促进植物生长，提高作物产量[46-47]；而镰刀菌属则是烟草根腐病致病菌属[48]。本研究发现，在移栽后30d，施肥处理提高了土壤碱解氮含量，降低了土壤pH。同时，施肥处理增加了木霉属相对丰度，降低了镰刀菌属相对丰度。土壤氮含量的增加会减少作物与真菌的竞争[49-50]，而木霉属真菌可利用氮素促进菌丝的生长[51]，这可能是木霉属相对丰度增加的原因。施肥通过提高土壤碱解氮含量和降低土壤pH 增加了木霉属相对丰度，降低了镰刀菌属的相对丰度。此外，腐质霉属是纤维素和木质素的分解者[52]，其相对丰度与土壤碱解氮含量呈正相关，其原因有待进一步探究。因此，不同施肥处理可能是通过改变土壤碱解氮含量和pH来影响真菌群落结构。

4 结论

不同施肥处理对土壤速效养分的影响较为显著，施肥尤其是施氮肥会降低土壤pH。不同施肥处理降低了土壤真菌多样性（移栽后30d）和丰富度（移栽后60d），并通过改变土壤养分和pH 影响真菌门和属水平的群落结构。重庆市丰都县植烟土壤中的碱解氮、速效磷、速效钾和pH 对真菌群落的组成影响显著，其中速效磷和碱解氮是主要影响因子。