响应面法优化破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取工艺

＊武悦 李若绮 徐勤科 郭朝晖 孙莺*

（1.甘肃省药品检验研究院 甘肃 730070 2.国家药监局中药材及饮片质量控制研究重点实验室 甘肃 730000）

灵芝孢子粉具有增强机体免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎症、抑制肿瘤、调节胃肠道菌群、缓解体力疲劳、保肝护肝、改善睡眠[1-5]等药理作用，近几年还有报道证实灵芝孢子粉对阿尔兹海默症有一定预防作用[6]。近年来，学者发现灵芝孢子粉中脂溶性物质含量较高，可达30%左右[7]，且这些脂溶性物质具有一定的生物活性，其中甘油三酯类被认为具有有效的抗肿瘤作用[8]，因此建立甘油三酯类物质含量的测定方法于破壁灵芝孢子粉质量标准的制定非常重要。本试验采用超声波法提取甘油酸油酸酯，建立了高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯的含量，为破壁灵芝孢子粉质量标准的制定提供参考依据。

1.材料与方法

(1)材料与试剂

破壁灵芝孢子粉样品由青海及祥药业有限公司提供；甘油三油酸酯对照品由中国食品药品检定研究院提供（供含量测定用，含量为：99.6%，批号：111692-202007）；二氯甲烷（色谱纯）国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）德国默克公司。

(2)仪器与设备

Agilent 1260系列液相色谱仪，美国安捷伦公司；Alltech ELSD-6000型蒸发光散射检测器，美国Alltech科技有限公司；梅特勒XS205DU电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SBL-30DT(N)型超声波恒温清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

(3)仪器工作条件

①色谱条件

色谱柱：SHISEIDO CAPCELLPAK C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；流动相:二氯甲烷:乙腈=68:32；漂移管温度：61℃；氮气流速：1.7L/min。

②对照品溶液的制备

精密称取甘油三油酸酯对照品适量，加流动相制成每1mL含0.7mg的溶液，即得。

(4)破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取

精密称取破壁灵芝孢子粉0.1g，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用流动相补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

(5)不同提取条件对破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取效果的影响

采用单因素试验考察料液比、超声功率、超声时间和超声温度对破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率的影响，再采用响应面法优化提取参数。

2.结果与分析

(1)单因素试验结果

①料液比对甘油三油酸酯提取率的影响

由图1可知，随着提取溶剂的增多，甘油三油酸酯的提取效果随之提高。当料液比为0.1:10时，测定甘油三油酸酯的含量仅为3.64%；当料液比为0.1:25时，测得甘油三油酸酯的含量显著升高，达4.92%；料液比为0.1:30时，测得甘油三油酸酯的含量稍有降低，为4.80%，但与料液比为0.1:25时测得甘油三油酸酯的含量差异不显著。

图1 料液比对甘油三油酸酯含量的影响

②超声功率对甘油三油酸酯提取率的影响

由图2可以看出，随着超声功率的增大，测得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。当超声功率为560W时，测得甘油三油酸酯的含量达4.92%；超声功率为640W时，甘油三油酸酯提取率显著下降至4.72%。

图2 超声功率对甘油三油酸酯含量的影响

③超声时间对甘油三油酸酯提取率的影响

由图3可以看出，随着超声提取时间的延长，测得甘油三油酸酯的含量先升高后降低。当提取时间为30min时，甘油三油酸酯的含量达到峰值，为4.92%；超声时间为40min时，甘油三油酸酯提取率稍有下降，为4.87%，但与超声30min时的提取率之间差异不显著。

图3 超声提取时间对甘油三油酸酯含量的影响

④超声温度对甘油三油酸酯提取率的影响

由图4可以看出，随着超声温度的升高，测得甘油三油酸酯的含量先平缓升高后显著降低。当超声温度为60℃时，甘油三油酸酯的含量达4.93%；超声温度为80℃时，甘油三油酸酯提取率显著下降至3.62%。

图4 超声提取温度对甘油三油酸酯含量的影响

(2)响应面优化试验结果

根据单因素试验结果，得到破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取的最佳条件为：料液比为0.1:25（g·mL-1），超声功率为560W，超声时间为30min，超声温度为60℃。在单因素试验的基础上，选取料液比、超声功率和超声时间三个因素进行三因素三水平的Box-Benhnken试验，进一步优化并筛选最佳的溶解条件（表1～表2）。

表1 Box-Benhnken试验因素水平表

表2 响应面试验的Box-Behnken设计及结果

对表3中得到的提取率进行回归分析，得到如下回归方程：

表3 回归模型及因素的方差分析

经方差分析可知（表3），该模型方程极显著。在本试验设定范围内，因素A、C、A2、B2、C2、AB、AC对甘油三油酸酯提取率影响极显著。模型的失拟项不显著，说明回归方程较好的拟合了试验数据，试验误差小。

(3)验证试验

利用Design Expert软件获得最佳提取条件：料液比为0.1:22.01，超声功率为550.93W，超声时间为31.19min，破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取率为5.08%。在各因素最佳条件下对响应面分析结果进行验证，考虑实际操作性，将最优提取条件修正为料液比0.1:25（g·mL-1），超声功率为560W，超声时间为30min。在此基础上试验进行五次，最终得到甘油三油酸酯平均提取率为5.01%，与预测值5.08%相近，相对误差为1.4%，表明模型可靠，可以用于破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取。

3.结论

采用响应面法优化破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯提取方法。利用响应面建立甘油三油酸酯提取率的二次多项式数学模型，并对三因素的响应值影响进行显著性分析，结果表明，所建模型拟合度高，实验误差小，最终确定提取条件为料液比0.1:25（g·mL-1），超声功率560W，超声时间30min。在此条件下，破壁灵芝孢子粉中甘油三油酸酯的提取率为5.01%，与预测值接近，模型可靠。